وباستخدام هذا البروتوكول، يمكن إنتاج lysates الخلايا البكتيرية عالية الجودة باستخدام معدات المختبر المشتركة المتاحة على نطاق واسع فقط، مما يجعل التعبير الجيني الخالي من الخلايا في متناول معظم الباحثين بسهولة. الجمع بين برنامج التحلل الذاتي الخلوي مع تجميد ذوبان أو تجميد الجافة دورة يسمح خلق نهج عملي، والعمل وفعالة من حيث التكلفة للإنتاج السريع من التحللات البكتيرية للتعبير الجيني خالية من الخلايا. ابدأ باستخدام حلقة تلقيح لتكسير خلايا سلالة E.coli التحلل التلقائي على لوحات أجار LB التي تحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسلين، ثم احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، وذلك باستخدام طرف ماصة، واختيار مستعمرة واحدة من لوحة أجار وإضافته إلى أنبوب الثقافة التي تحتوي على LB المتوسطة مع الأمبيسلين. تنمو هذه الثقافة بداية في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إضافة 400 ميكرولتر من ثقافة المبتدئين في قارورة Erlenmeyer لتر واحد تحتوي على 400 ملليلتر من المتوسط 2xYTPG تكملها 50 ميكروغرام لكل ملليلتر الأمبيسلين.
احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 300 دورة في الدقيقة. باستخدام مطياف وcuvette البصرية مع طول مسار سنتيمتر واحد، وقياس دوري الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر. عندما تتجاوز الكثافة البصرية واحدة، ابدأ في تمييع الثقافة خمسة أضعاف قبل القياسات لضمان بقاء القياسات ضمن النطاق الخطي لمطياف مختبر نموذجي.
بمجرد أن تصل الكثافة البصرية للثقافة المخففة ذات الخمسة أضعاف إلى 0.3 ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة وشرع في إعداد الليحات. لإعداد اللستات، احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1، 800 × ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. صب قبالة supernatant وإزالة السائل المتبقي باستخدام ماصة.
إضافة 45 ملليلتر من العازلة S30A الباردة إلى بيليه وإعادة إنفاق بيليه عن طريق الدوامة. ثم، وزن أنبوب طرد مركزي فارغ 50 ملليلتر قبل نقل الخلايا إلى الأنبوب. طرد الخلايا مرة أخرى والتخلص من supernatant.
يستنشق أي ما تبقى من الناسخة باستخدام ماصة. وزن الأنبوب مرة أخرى وطرح وزن الأنبوب الفارغ من الوزن المعروض للحصول على وزن بيليه. لكل ملليغرام واحد من بيليه الخلية، إضافة اثنين من ميكرولتر من العازلة S30A الباردة تكملها مع اثنين من dithiothreitol ملليمول.
ثم، إعادة إنفاق الخلايا عن طريق دوامة قوية. بعد ذلك ، تجميد الخلايا عن طريق وضعها في تجميد سالب 20 أو 80 درجة مئوية سالبة حتى يتم تجميد بيليه تماما ، ثم إذابة الخلايا في حمام الماء درجة حرارة الغرفة ودوامة بقوة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز في 300 دورة في الدقيقة، ثم مسح عينة من الحطام الخلوي الثقيل عن طريق الطرد المركزي في أنابيب الطرد المركزي شفافة في 30،000 × غرام لمدة 45 دقيقة في أربع درجات مئوية.
نقل بعناية supernatant إلى أنبوب جديد مع ماصة، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. إذا كان الناطور المنقول ملوثا بمواد من الكريات ، فتكرر الطرد المركزي. نقل الناطور إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.
والطرد المركزي مرة أخرى في 21، 000 x ز أو السرعة القصوى للطرد المركزي الطاولة لمدة خمس دقائق. Aliquot مسح autolysate في المجلدات المطلوبة وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام. للتعبير الجيني الخالي من الخلايا باستخدام المزج التلقائي، اخلط ثمانية ميكرولترات من التلاء التلقائي و8.9 ميكرولتر من المزيج المسبق على الجليد.
إضافة الحمض النووي إلى تركيز النهائي من ثمانية نانومول، أي الكواشف الضرورية الأخرى والمياه للحصول على حجم النهائي من 20 ميكرولتر. أضف التفاعل إلى لوحة صغيرة 384 جيدا واستخدم قارئ لوحة لقياس مسار وقت الفلورسينس ونقاط النهاية. GFP التعبير باستخدام autolysate مع سلسلة تخفيف من الحمض النووي البلازما النتائج في تعبير قوي حتى مع الحمض النووي نانومولار واحد.
عند مقارنة التعبير GFP بين lysate المتاحة تجاريا و autolysate، أنتجت autolysate مستويات مماثلة من GFP. كان التباين بين دفعات من اليسات المنتجة في مختبرين مختلفين من قبل باحثين مختلفين ضمن حوالي شقين. المتغيرات الثلاثة الأكثر أهمية هي نسبة بيليه الخلية إلى المخزن المؤقت ، ونقل supernatant خالية من الحطام واستخدام تركيز PEG والمغنيسيوم الأمثل في رد الفعل النهائي.
وبمجرد إعداد المستخلص، يمكن استخدام ترسانة كبيرة من البروتوكولات القائمة التي تم تطويرها لأنظمة التعبير الخالي من الخلايا E.coli، مثل التدهور بوساطة ClpXP، أو استشعار النصاب القانوني بوساطة AHL.
