نشكر آدم كوستر وجميع الأعضاء الآخرين في Altschuler ووو مختبرات لردود الفعل والمناقشات المفيدة. هذا البحث كان مدعوما من المعهد الوطني للصحة منح R01 GM085442 وCA133253 (SJA)، R01 GM081549 (LFW)، CPRIT RP10900 (LFW)، ومؤسسة وولش I-1619 (SJA) وI-1644 (LFW).

1. إعداد العينات والتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الثقافات بشكل روتيني والحفاظ على 20-70٪ التقاء. يوم واحد قبل التجربة، وتنمو خلايا هيلا في DMEM (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، انظر جدول المواد) وتستكمل مع FBS 10٪ (مصل بقري جنيني) و 1X البنسلين / الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التجربة، وخلايا الانقسام المتزايد في الثقافة (حوالي 50٪ متموجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة)، تعرض إلى حوالي 2 مل من التربسين / EDTA (حمض Ethylenediaminetetraacetic) لبضع ثوان. نضح الزائدة التربسين / EDTA والحفاظ على خلايا استحم في طبقة رقيقة من التربسين / EDTA في غطاء محرك السيارة على RT ل~ 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكانيكيا يهز القوارير مرتين وفصل الخلايا مع المصل تستكمل وسائل الإعلام. عد الخلايا وتضعف إلى 5،000 cells/50 ميكرولتر من وسائل الإعلام وعلى الفور لوحة 50 ميكرولتر / جيد على لوحة الزجاج 384 جيدا أسفل باستخدام الروبوت الآلي التعامل مع السائل (فقط 30 جيدوتستخدم لوحة من ليالي هنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في RT لمدة 30 دقيقة لتقليل آثار الحافة في الآبار 5. بعد لوحات RT الحضانة، والمكان في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيتم يعاير كل المخدرات في مكررة. إضافة 25 ميكرولتر من المخدرات إلى الآبار المقابلة على لوحة تحتوي على وسائل الإعلام بالفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح اللوحة مع 4٪ محلول بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني في 24 العلاج من تعاطي المخدرات آخر ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلطيخ يتم سرد الأجسام المضادة المحددة الابتدائية، والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى والبقع الفلورسنت الأخرى التي تم استخدامها هنا في جدول المواد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize خلايا ثابتة مع 0.2٪ تريتون X-100 الحل في TBS (المالحة تريس مخزنة) لمدة 3 دقائق، وتغسل مع TBST (المالحة تريس مخزنة + توين 20) 3X. إضافة 5٪ BSA (الأبقار مصل الزلال) حل في TBST للحظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في RT لمدة 2 ساعة ثم يغسل مع TBST 3X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مخفف الأجسام المضادة الأوليةالأيونات في 5٪ BSA في TBST (انظر جدول المواد)، وإضافة 10 ميكرولتر / جيد. احتضان لوحة في RT لمدة 2 ساعة، ثم يغسل 3X مع TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل dilutionin الضد الثانوية 5٪ BSA في TBST (انظر جدول المواد)، وإضافة 10 ميكرولتر / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في الظلام في RT لمدة 2 ساعة ثم يغسل مرتين مع TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير التخفيفات لهويشت وphalloidin (انظر جدول المواد) في برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولتر / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في الظلام لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 يغسل TBST، بطانات في احباط وتخزينها في 4 درجات ثاني / N. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير الحصول على الصور باستخدام المجهر epifluorescence باستخدام الهدف 20X مع الكاميرا 1X1 binning. الحصول على ستة عشر صور لكل بئر، ليصبح المجموع 480 صور (قنوات X3). </li></ol> 2. تحليل الصور تحميل وتثبيت PhenoRipper من phenoripper.org، وإطلاق PhenoRipper لبدء تحليل معهد العالم العربيغيس. يدعم PhenoRipper حاليا TIFF، PNG، و JPEG وجميع الأشكال الأخرى التي يدعمها MATLAB (البرمجيات عادة المجهر دعم التصدير إلى TIFF). 2.1 بيانات تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يوجد اصطلاح التسمية / المنظمة القياسية للصور المجهري، والتي يمكن أن تجعل تحميل الصور والبيانات الوصفية ربط (أي الشرح التجريبية مثل نوع العلاج، وكذلك عدد وهلم جرا) الجزء الأكثر تحديا لسير العمل. اختيار واحد من الأساليب المقدمة (موضح أدناه). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PhenoLoader: اختر هذا الخيار لشبه تلقائيا تحميل البيانات عندما يكون اسم الملف و / أو بنية الدليل يحتوي على معلومات كافية لصور مجموعات كما تريد (على سبيل المثال B16 HeLa_Drug5-DAPI.png قد تشير إلى أن الصورة هي من بئر B16، يتم التعامل مع الخلايا مع المخدرات التي ID هو 5، ويلتقط الصورة وصمة عار دابي النووية - مع هذا اصطلاح التسمية، وجميع الصور من A1 جيدا أو تعامل مع المخدرات 5 يمكن تجميعها بسهولة). سوف المعالجتوجيه المستخدم خطوة بخطوة لربط البيانات الوصفية مع مجموعات الصور وتحديد علامات على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;هيكل ملف&quot; للوصول إلى إطار PhenoLoader. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;تعريف الدليل الجذر&quot; لتحديد الدليل الذي يحتوي على صورة البيانات. ثم تحديد الملفات التي لا تستخدم (الملفات غير المستخدمة) لتحليل (اختياري، يمكن أن تترك فارغة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;تعريف علامات&quot; لتحديد المؤشرات الحيوية المستخدمة في التجربة وربطها مع الصور. على وجه التحديد، انقر على ملف صورة ثم تحديد جزء من اسم الملف الذي يعرف بشكل فريد المؤشرات الحيوية. أخيرا، أدخل اسما للكل العلامات البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;تعريف الفوقية&quot; لربط المعلومات مع كل صورة. على وجه التحديد، انقر على ملف الصورة، ومن ثم تحديد جزء من اسم الملف تحديد معلومات الصورة (على سبيل المثال &quot;B16&quot; لاسم أيضا). نافذة يسأل عن اسم المجموعة (على سبيل المثال &quot;نحنليرة لبنانية &quot;) سوف يطفو على السطح، أدخل اسما. سيتم عرض أعضاء المجموعة المستخرجة من اسم الملف على جدول المجموعة (على سبيل المثال على القائمة الكاملة للأسماء أيضا). لإضافة معلومات إضافية غير موجودة في اسم الملف، انقر على&quot; (اختياري) التالي &quot;الزر. انقر على&quot; إضافة البيانات الوصفية المجموعة &quot;، أدخل اسم مجموعة إضافية (على سبيل المثال&quot; مخدرات &quot;) ولكل قيمة من مجموعة محددة مسبقا (على سبيل المثال&quot; حسنا &quot;)، أدخل قيمته (على سبيل المثال&quot; تاكسول &quot;) وليس هناك حد لعدد من الجماعات الإضافية التي يمكن إضافتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، انقر على &quot;إنشاء Metadatafile&quot; لإنشاء ملف التعريف ومواصلة التحليل. إذا تم إنشاء ملف التعريف السابق، الخطوات المذكورة أعلاه يمكن تجنبها عن طريق تحميل الملف مباشرة باستخدام خيار &quot;بيانات ميتا ملف&quot; (وصفها في 3 أدناه). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قوالب التعبير العادية استنادا: التعبيرات العادية هي نهج موحد لمطابقة أنماطفي النص. اختيار هذا الخيار عندما يكون اسم الملف و / أو بنية الدليل يحتوي على معلومات كافية لمجموعة الصور واصطلاح التسمية يطابق أحد القوالب الموجودة من قبل. القوالب المخصصة على أساس التعابير العادية ويمكن أيضا تعريف وإعادة استخدامها يدويا. ويوصى هذا الخيار للمستخدمين المتقدمين فقط مألوفة مع التعابير العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفوقية الملف: اختر هذا الخيار لالتفصيل في نهاية المطاف. تحديد وتحميل فاصلة فصل القيم (CSV) ملف يحتوي على أسماء الملفات والبيانات الوصفية المرتبطة بها مع كل صورة. مثال على تنسيق الملف يتوفر على تحميل جزء من موقع على شبكة الإنترنت (phenoripper.org). ببساطة تحميل الملف من خلال واجهة لعرض المعلومات التي يحتوي عليها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الحقل البيانات الوصفية التي تحدد مكررات في التجربة لتجنب أخذ العينات زائدة عن الحاجة. لمجموعات البيانات التي تحتوي على مكررات (يجب أن يكون على سبيل المثال جميع الصور في بئر مماثلة)، تجميعها معا (مثلا جيدا) يمكن الظهورأداء اوفه. في معظم الحالات فمن المعقول أن تختار الخيار الافتراضي &quot;عشوائية (لا أعرف)&quot; الذي يختار مجموعة فرعية عشوائي. </li></ol> 2.2 إعداد تحليل معلمات انقر على &quot;مجموعة معلمات&quot; لتعريف المعلمات المطلوبة لمعالجة البيانات. المعلمات لتعريف هي على اللوحة اليسرى. تعرض لوحة الحق عينة من مجموعة البيانات المدمجة. انقر على الأسهم يسار / يمين للتبديل بين الصور المختلفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عتبة كثافة: اختيار قيمة العتبة المناسبة لتحديد ما يقرب من الأجزاء الخلوية (بدلا من الخلفية، والمناطق noncellular) من الصور. وprecalculated عتبة بواسطة PhenoRipper، ولكن يمكن تعديلها لتحسين تسليط الضوء على المناطق الخلوية باستخدام شريط التمرير متوفرة في أعلى الصورة. إذا لم يعمل عتبة اختار في جميع الصور، وانخفاض عتبة بحيث تشمل المناطق noncellular بدلا من اسقاط المناطق الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة Sإيزي: اختيار حجم الكتلة المناسبة (بالبكسل) لشبكة الصورة. سيتم فرضه كتل من الحجم المحدد على الصورة. ضبط حجم الكتلة للحصول على ما معدله 20-30 كتل / خلية. لركب الشبكة فوق الصورة، انقر على مربع الاختيار أمام حقل &quot;حجم الكتلة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معلمات اختيارية: إذا كانت الصور تحجيم السيارات لا تعرض علامات مع شدة النسبي المطلوب (غير المشبعة مثل لون واحد) أو إذا كان في حاجة إلى إسقاط علامات من التحليل، واستخدام &quot;ضبط شدة قناة&quot; الخيار. لتحديد المناطق الخلوية على مجموعة فرعية من علامات استخدام &quot;القنوات المستخدمة لعتبة&quot; الخيار. الخيارات الافتراضية من المعلمات الأخرى وعادة ما تكون كافية، ولكن إذا لزم الأمر، وضبط لهم باستخدام &quot;خيارات تحليل متقدمة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل تحليل عن طريق الضغط على &quot;PhenoRip&quot; على لوحة التطبيق الرئيسي. وسوف يحدد تلقائيا PhenoRipper أنواع كتلة المتكررة في الصور. سيتم إنشاء ملفات تعريف المظهري لكل صورة على أساس أجزاء من أنواع مختلفة كتلة فيه. </li></ol> 3. استكشاف النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكشاف العلاقات بين التشكيلات المظهري من الصور باستخدام PhenoBrowser (الشكل 1). تتكون واجهة PhenoBrowser من أربع لوحات: لوحة أعلى اليسار هو تمثيل رسومي (مؤامرة مبعثر) من التشابه النسبي بين مختلف الصور / الشروط، الفريقين على حق الصور عرض عينة ظروف المحددة، واللوحة النهائية (شريط الرسم البياني ) يقارن الشخصية المظهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;تجاهل إطارات فارغة&quot; باستخدام القائمة &quot;معالجة البيانات&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة صور ذات نوعية رديئة: أولا، لدراسة الصور الفردية إيقاف التجميع من القائمة &quot;معالجة البيانات&quot;. المقبل، انقر فوق من خلال نقاط عزلاء في مؤامرة مبعثر وتجاهل الصور منخفضة الجودة (على سبيل المثال من التركيز، قطعة أثرية تلطيخ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكشاف البيانات: بيانات التعريف التي تقرر يعرف الحقلوحدة أساسية للمقارنة (على سبيل المثال للمقارنة بين العقاقير والصور مع نفس قيمة الحقل الفوقية &quot;المخدرات&quot; بحاجة إلى أن تجمع معا). طي كافة الصور مع نفس قيمة هذا الحقل الفوقية إلى نقطة بيانات واحدة مع &quot;المجموعة حسب&quot;. على سبيل المثال، سوف تجمع من خلال المخدرات متوسط ​​الصور داخل كل لانتاج المخدرات نقطة واحدة في المخدرات. تعكس النقاط القريبة (أو البعيد) في مؤامرة مبعثر الظروف التي تثير الظواهر الخلوية مماثلة (أو متباينة). لون أو تسمية نقطة (القائمة عرض البيانات) على أساس البيانات الوصفية المتوفرة للمساعدة للتفسير. مؤامرة 3D هو للتدوير من خلال النقر على مربع الاختيار &quot;تدوير&quot; وبالضغط على الزر الأيسر وسحب الماوس فوقها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد وجهتي نظر مختلفتين لمقارنتها مباشرة. فإن لوحات عرض الصور صورة عينة لكل نقطة، وسوف تظهر لوحة الرسم البياني شريط أنواع كتلة التي هي الأكثر مختلفة بين النقطتين الترددات حدوثها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق جlustergram من &quot;القائمة Clustergram&quot; لتقديم وجهة نظر أكثر عالمية للعلاقة بين أنواع كتلة والظروف التجريبية. من خلال تجميع كلا النوعين كتلة والظروف، وهذا يسلط الضوء على تمثيل الظواهر الخلوية التي تميز أفضل مجموعات من الظروف (الشكل 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+for+microscopy.">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, (2006).</li><li>Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+Recognition+Software+and+Techniques+for+Biological+Image+Analysis.">Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis.</a> PLoS Comput. Biol. 6, (2010).</li><li>Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhenoRipper:+software+for+rapidly+profiling+microscopy+images.">PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images.</a> Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).</li><li>Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+heterogeneous+cellular+responses+to+perturbations.">Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).</li><li>Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+digital+microscope+images.">Quantitative analysis of digital microscope images.</a> Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).</li><li>Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+calibration+in+fluorescence+microscopy.">Image calibration in fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 216, 15-24 (2004).</li><li>Shamir, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wndchrm+-+an+open+source+utility+for+biological+image+analysis.">Wndchrm - an open source utility for biological image analysis.</a> Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).</li><li>Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+and+visual+differentiation+of+subcellular+imaging.">Statistical and visual differentiation of subcellular imaging.</a> BMC Bioinform. 10, 94 (2009).</li><li>Huang, K., Murphy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+classification+of+subcellular+patterns+in+multicell+images+without+segmentation+into+single+cells.">Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells.</a> 2, 1139-1142 (2004).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

سير العمل الموصوفة هنا يسمح توصيف سريع وسهل والمقارنة بين الصور المجهري. أثبتنا أولا كيف يمكن أن يساعد هذا العمل الأمثل التجربة، على سبيل المثال عن طريق إجراء سريعا لمراقبة الجودة على الصور المجهري. المقبل، أثبتنا قدرته على تحليل البيانات الفرز الفائق الإنتاجية: كن?...

على مدى العقد الماضي، أعطت التقدم السريع في تكنولوجيا التصوير العديد من مختبرات القدرة على أداء عالية الإنتاجية المجهري. تحول التحدي الآن من واحدة من التصوير إلى واحد من التحليل. كيف يمكننا أن تميز، قارن، واستكشاف سيل من الظواهر المعقدة حتى الآن خفية إنشاؤها بواسطة عالية الإنتاجية الشاشة التصوير نموذجية؟ وقد منح عدد من منصات صورة التحليل والمعلوماتية مستخدمين أدوات العمل المتطورة 1-3 لاستخراج المعلومات البيولوجية من مجموعات كبيرة من الصور. ومع ذلك لا تزال هناك الكثير من العقبات كبيرة في تحليل البيانات من على شاشات الصورة القائمة على الإنتاجية العالية. الصعوبات التي ينطوي مع اختيار الأوصاف المناسبة للصور وضبط من المعلمات حسابي (لنظام الفائدة) غالبا ما تؤدي في أوقات الإعداد الطويلة، لا سيما بالنسبة للمستخدمين بدون خبرة صورة التحليل. على وجه الخصوص، وتجزئة الخلية، وعملية تحديد الخلايا الفردية فين الصورة، هو عقبة رئيسية في هذا الصدد. تجزئة يمكن أن تكون حساسة للغاية لمعلمات التجريبية مثل نوع من الخلايا، كثافة الخلية وعلامات الحيوية، وكثيرا ما يتطلب التكيف المتكررة لمجموعة البيانات الكبيرة. لهذه الأسباب، تحليل الصور غالبا ما يكون خطوة مستقلة، محطة يؤديها المتخصصين بدلا من جزءا لا يتجزأ من سير العمل التجريبية. هذا ما يحول دون دورة التقييم السريع بين التحليل والتجربة، جزءا أساسيا من التنمية الفحص. نحن هنا وصف سير عمل البديلة التي هو الأمثل لارتفاع الإنتاجية مضان المجهري ويتجنب العديد من الصعوبات المذكورة آنفا. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن الاستفادة من PhenoRipper 4، منصة برمجيات المصدر المفتوح للاستكشاف وتحليل الصور المجهري السريع. بشكل ملحوظ، PhenoRipper يتجنب العديد من التحديات التي ينطوي مع تجزئة الخلية من خلال عدم محاولة التعرف على الخلايا واحد. بدلا من ذلك، PhenoRipper يقسم الصور إلى بكسلكتل من حجم التحت خلوية وتميز في الصور من حيث الكتل التي تحتوي عليها. على وجه التحديد، لمحات PhenoRipper كتل من حيث المستندة إلى colocalization علامة الميزات وتلقائيا يحدد 4 أنواع كتلة الأكثر تمثيلا في الصور التدريب. PhenoRipper ثم يعين على كل كتلة الأكثر مماثلة نوع كتلة ممثل، وأخيرا الصور يميز على أساس أنواع من الكتل التي تحتوي عليها. بالمقارنة مع النهج القائم على خلية واحدة أكثر تقليدية، وهذا النهج يتطلب الحد الأدنى من ضبط والخبرة ما يرام. على هذا النحو، يحتاج المستخدمون فقط إلى وضع معلمتين: حجم كتلة وكثافة عتبة (لتجاهل أجزاء noncellular من الصورة)، وكلاهما مع مجموعة ردود الفعل الرسومية. الأهم من ذلك، وقد تبين سير العمل الموصوفة هنا 4 لتوسيع نطاق بسهولة إلى مجموعات البيانات أكبر من ذلك بكثير، حيث السرعة والحد الأدنى من ضبط يوفر وقتا كبيرا ومكاسب الموثوقية. في الممارسة العملية، نجد أن هذا التطبيقصرصور يقلل من الوقت اللازم لإعداد كل من وتشغيلها بواسطة أوامر متعددة من حجم 4. الناتج الرئيسي لPhenoRipper هو تمثيل مرئي للصورة التشابه، والتي تمكن المستخدم لتحديد مجموعات من الظروف التجريبية التي تسبب الخلايا لعرض الظواهر المشابهة. التجمعات PhenoRipper يجد عادة ما يكون مقارنة &quot;للتفسير البيولوجي&quot; لتلك التي تم إنشاؤها بواسطة أكثر من ذلك، أساليب خلية مقرها تستغرق وقتا طويلا 4. في الممارسة العملية، وهذا يعني أن في كثير من الأحيان، في غضون نصف ساعة من إجراء 96 تجربة جيدة مضان المجهري نموذجي، وهو مجرب بدون خبرة سابقة الصورة التحليل يمكن الحصول على قراءات موثوقة حول أداء التجربة له أو لها. يمكن المجرب ثم البدء في استكشاف العلاقات بين ظروف تجريبية مختلفة وتتعلق هذه العلاقات إلى الظواهر الصورة. ونحن لشرح سير العمل هذا هنا من خلال تحليل الآثارالمخدرات في صفوف الآلية واضحة على خلايا هيلا ملطخة عن علامات الحمض النووي وهيكل الخلية. تم تجميع الصور من الخلايا تعامل مع نفس الفئة من الأدوية معا، وظهرت الصور رديئة الجودة (تلطيخ التحف، للخروج من خلايا التركيز وهلم جرا)، والقيم المتطرفة، مما يجعلها سهلة لتحديد ويحتمل تجاهل. في حين أن هذا العمل مفيد لعدد كبير من المقايسات الصورة القائمة، وهناك العديد من الحالات التي يكون فيها بوضوح نهجا مختلفا من المحتمل أن تكون أكثر إفادة. على سبيل المثال، الإخراج من PhenoRipper هو في المقام الأول مقارنة النسبية للأنماط مضان عبر الظروف التجريبية. إذا كان مطلوبا لتوصيف المطلقة سمة محددة خلية واحدة بدلا من ذلك (على سبيل المثال عدد البقع في خلية)، سوف تكون هناك حاجة إلى تحليل واحد المستندة إلى الخلية. مع ذلك، وحتى في هذا النوع من الحالات، ومن المرجح أن كشف التغيرات في هذه الظواهر وحيدة الخلية، وبالتالي PhenoRipper أن تكون أداة مفيدة لفحص الأمثلmization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="855">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11965</td>
			<td style="width:404px;">High Glucose, L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Marker Hoechst 33342</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">H1399</td>
			<td style="width:404px;">DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Marker phalloidin-Alexa488</td>
			<td style="width:116px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated phallotoxin, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Primary Antibody &#945;-tubulin</td>
			<td style="width:116px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T9026</td>
			<td style="width:404px;">Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Secondary Antivody anti-Mouse TRITC</td>
			<td style="width:116px;">Jackson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">115-025-166</td>
			<td style="width:404px;">Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Aldosterone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apicidin</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Colchicine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.16 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cortisol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Docetaxel</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M344</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :20 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS-275</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prednisolone</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RU486</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Scriptaid</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :70 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taxol</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trichostatin A</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinorelbine</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:404px;">concentration used :0.3 &#956;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis and exploration of fluorescence microscopy images

على الرغم من التقدم السريع في الإنتاجية العالية المجهري، كمي المقايسات الصورة القائمة لا تزال تشكل تحديات كبيرة. في حين أن مجموعة متنوعة من أدوات تحليل الصور المتخصصة المتاحة، معظم سير العمل التقليدية القائمة صورة التحليل بوجود منحنيات التعلم حاد (لضبط المعلمات التحليل) وينتج في أوقات التحول الطويلة بين التصوير والتحليل. على وجه الخصوص، وتجزئة الخلية، وعملية تحديد الخلايا الفردية في صورة، هو عقبة رئيسية في هذا الصدد. هنا نقدم بديل، الخلية خالية من تجزئة العمل على أساس PhenoRipper، وهو منصة البرمجيات مفتوحة المصدر مصممة لتحليل السريع واستكشاف الصور المجهري. هو الأمثل لخطوط الأنابيب المعروضة هنا للصور المناعي المجهري الثقافات الخلية ويتطلب الحد الأدنى من تدخل المستخدم. في غضون نصف ساعة، ويمكن PhenoRipper تحليل البيانات من تجربة 96 جيدا نموذجية وتوليد ملامح الصورة. يمكن للمستخدمينثم بصريا استكشاف البيانات الخاصة بهم، وأداء مراقبة الجودة على تجربتهم، وضمان استجابة للاضطرابات والتحقق من استنساخ مكررات. هذا يسهل دورة التقييم السريع بين التحليل والتجربة، وهو أمر حاسم خلال الفحص الأمثل. هذا البروتوكول هو مفيد وليس مجرد تحليل مرور الأول لمراقبة الجودة، ولكن أيضا يمكن أن تستخدم كحل نهاية إلى نهاية، وخاصة بالنسبة للفحص. سير العمل الموصوفة هنا إلى جداول مجموعات كبيرة من البيانات مثل تلك الصادرة من شاشات عالية الإنتاجية، ولقد ثبت لظروف تجريبية بواسطة مجموعة النمط الظاهري بدقة أكثر من مجموعة واسعة من النظم البيولوجية. يوفر واجهة بديهية PhenoBrowser إطارا لاستكشاف الفضاء المظهري وتتصل خصائص الصورة إلى الشروح البيولوجية. أخذت معا، فإن بروتوكول الموصوفة هنا خفض الحواجز التي تحول دون اعتماد التحليل الكمي للشاشات الصورة القائمة.

نحن هنا اختبار قدرة هذا العمل على الأدوية المجموعة على أساس آلية عملها. وكانت المصنفة خلايا هيلا في 30 بئرا من لوحة 384 جيدا والملون لDNA / الأكتين / α-تويولين. يتم سرد الأجسام المضادة المحددة الابتدائية، والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى، والبقع الفلورسنت الأخرى ?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

نحن هنا وصف سير العمل بسرعة لتحليل واستكشاف مجموعات من الصور مضان المجهري باستخدام PhenoRipper، منصة تحليل الصورة وضعت مؤخرا.

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

rapid-analysis-and-exploration-of-fluorescence-microscopy-images

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K Views.  UT Southwestern Medical Center.  نحن هنا وصف سير العمل بسرعة لتحليل واستكشاف مجموعات من الصور مضان المجهري باستخدام PhenoRipper، منصة تحليل الصورة وضعت مؤخرا. 

Video: Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

ديناميات القلة من مستقبلات سطح الخلية في الخلايا الحية من قبل المجهر الداخلي الكلي انعكاس الشامل مع عدد وتحليل السطوع

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These processes are characterized by the gradual appearance of essential structures in the megakaryocyte cytoplasm such as a polyploid and polylobulated nucleus, an internal membrane network called demarcation membrane system (DMS) and the dense and alpha granules that will be found in circulating platelets. In this article, we describe a standardized protocol for the in situ ultrastructural study of murine megakaryocytes using transmission electron microscopy (TEM), allowing for the identification of key characteristics defining their maturation stage and cellular density in the bone marrow. Bone marrows are flushed, fixed, dehydrated in ethanol, embedded in plastic resin, and mounted for generating cross-sections. Semi-thin and thin sections are prepared for histological and TEM observations, respectively. This method can be used for any bone marrow cell, in any EM facility and has the advantage of using small sample sizes allowing for the combination of several imaging approaches on the same mouse.

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Here, we present a protocol to analyze ultrastructure of the megakaryocytes in situ using transmission electron microscopy (TEM). Murine bone marrows are collected, fixed, embedded in epoxy resin and cut in ultrathin sections. After contrast staining, the bone marrow is observed under a TEM microscope at 120 kV.

في سيتو استكشاف مورين ميغاكاريوبويز باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

تثبيت سريع في Vivo وعزل المجمعات الترجمية من الخلايا Eukaryotic

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ranging from solid-state, O2-sensitive coatings to live animal tissue samples stained with soluble O2-sensitive probes. In particular, the nanoparticle-based near-infrared probe NanO2-IR, which is excitable with a 625 nm light-emitting diode (LED) and emits at 760 nm, was used. The imaging system is based on the Timepix3 camera (Tpx3Cam) and the opto-mechanical adaptor, which also houses an image intensifier. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) is commonly required for various studies, but current platforms have limitations in their accuracy, general flexibility, and usability.
The system presented here is a fast and highly sensitive imager, which is built on an integrated optical sensor and readout chip module, Tpx3Cam. It is shown to produce high-intensity phosphorescence signals and stable lifetime values from surface-stained intestinal tissue samples or intraluminally stained fragments of the large intestine and allows the detailed mapping of tissue O2 levels in about 20 s or less. Initial experiments on the imaging of hypoxia in grafted tumors in unconscious animals are also presented. We also describe how the imager can be re-configured for use with O2-sensitive materials based on Pt-porphyrin dyes using a 390 nm LED for the excitation and a bandpass 650 nm filter for emission. Overall, the PLIM imager was found to produce accurate quantitative measurements of lifetime values for the probes used and respective two-dimensional maps of the O2 concentration. It is also useful for the metabolic imaging of ex vivo tissue models and live animals.

This paper describes the use of a new, fast optical imager for the macroscopic photoluminescence lifetime imaging of long decay emitting samples. The integration, image acquisition, and analysis procedures are described, along with the preparation and characterization of the sensor materials for the imaging and the application of the imager in studying biological samples.

تصوير ماكرو مضان مدى الحياة للتطبيقات الطبية الحيوية

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...