تلقت عمل يؤدي إلى هذا المنشور بتمويل من برنامج ماري كوري COFUND &quot;U-التنقل&quot;، تمويله من قبل جامعة ملقة والبرنامج الإطاري الاتحاد الأوروبي ال 7 (FP7/2007-2013) تحت رقم 246550 GA. ويدعم عمل في مختبرنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، وزارة الزراعة / NIFA، جبهة الخلاص الوطني، BARD، والبنك السعودي الفرنسي لVC

1. التعبير البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار نظام التعبير حدد نظام، أي النواقل وطريقة التسليم ناقلات، وأفضل ملاءمة للتعبير عن البروتين من الفائدة في النموذج الحي / خلية معينة. نلاحظ أن لدينا فحص يتطلب التعبير من البروتينات اختبار بكميات اكتشافها بسهولة، والذي يتحقق على أفضل وجه عن طريق التحول عابرة أعداد كبيرة من الخلايا. في النباتات، على سبيل المثال، وهذا هو أفضل إنجاز باستخدام البلازميدات ثنائية كما ناقلات التعبير والأجرعية كنظام التسليم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء ناقلات التعبير الثنائية استنساخ تسلسل الترميز (ق) من البروتين (ق) من الفائدة الى ناقلات التعبير إما وحده أو في الانصهار متعدية إلى علامة حاتمة. استخدام نواقل ملائمة لنظام التعبير المختار وإجراءات البيولوجيا الجزيئية القياسية لاستنساخ الجينات. لبوساطة الأجرعية توصيل الجينات، وتوظيف نواقل ثنائية وتعريفهم، أيضا باستخدام standaبروتوكولات الثالثة، إلى سلالة الأجرعية، مثل EHA105، على التلقيح لاحقة من الأنسجة النباتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الأنواع النباتية تحديد الأنواع النباتية التي سيتم التعبير البروتين (ق) من الفائدة. نلاحظ أنه، في حين أن أي نوع من النباتات عرضة للتحول الجيني بوساطة الأجرعية يمكن استخدامها، والأنواع النباتية لدينا من خيار غير نيكوتيانا benthamiana الذي يزرع بسهولة، عرضة للالأجرعية، ولها أوراق كبيرة والتي يتم تلقيح بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نمو النبات تنمو مصنع واحد لمدة 4 إلى 6 أسابيع في وعاء مع الموالية للميكس BX في وعاء (20 سم × 20 سم × 20 سم) تحت ظروف خاضعة للرقابة للبيئة (على سبيل المثال، وغرفة النمو) من يوم طويل (أي 16 ساعة من 130 -150 م μE-2-1 ق النور في 23 درجة مئوية و 8 ساعات الظلام في 20 ° C) والرطوبة النسبية 40-65٪. 1.5.2 تسميد أحيانا مع المنتجات المتاحة تجاريا في تعليمات الشركة الصانعة. مرة واحدة ويزرع النبات، حدديترك مع حجم 50 ملم × 70 ملم أو أكبر (هذه القياسات لا تشمل طول سويقات) لالأجرعية التلقيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التلقيح مع الأجرعية تنمو سلالة الأجرعية إيواء بناء الثنائية معربا عن البروتين اختبار (ق) من الخطوة 1.3 بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في المتوسط ​​YEP (1٪ ببتون، 1٪ خلاصة الخميرة، و 0.5٪ كلوريد الصوديوم) تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال، 100 ملغ / L الستربتوميسين و 10 ملغم / لتر الريفامبيسين لناقلات المستندة pPZP-RSC2-24-25). 1.6.2 الطرد المركزي الخلايا، معلق لOD 600 = 0.5 في المخزن تسلل [10 ملي MgCl 2، 10 ملي مس (الرقم الهيدروجيني 5.6)، و 100 ميكرومتر acetosyringone]، واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اختراق الثقافة في الجانب مجافي المحور من ورقة، وذلك باستخدام needleless حقنة 1 مل، علما أن الأوراق يتم تلقيح في الموقع، في حين تعلق على النبات. 1.6.3 بعد تسلل، وتنمو النباتات لمدة 72 ساعة تحت ضوء نظام 16 ساعة 130-150 و# 181؛ م E-2-1 ق النور في 23 ° C / 8 ساعات الظلام في 20 ° C قبل الحصاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مثبطات proteasomal لدعم فكرة أن البروتين اختبار (ق) هو المتدهورة عبر مسار proteasomal، استخدام مثبطات proteasomal MG132 محددة وlactacystin 28-29، والتي ينبغي أن يقلل أو حتى منع تدهورها. أربع ساعات قبل الحصاد (انظر الخطوة 2.1)، التسلل إلى مناطق أوراق تلقيح الأجرعية مع 10 ميكرومتر MG132 (EMD ميليبور) أو 10 ميكرومتر lactacystin (سيغما الدريخ) أو وهمية علاج ورقة مع المذيبات منها، أي 0.1٪ DMSO أو الماء المقطر. </li></ol> 2. إعداد مقتطفات خالية من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد نبات حصاد المناطق تلقيح من ورقة، وعادة كاليفورنيا. 200-400 ملغ من الوزن الطازج، وطحن لهم في مسحوق ناعم في النيتروجين السائل. بدلا من ذلك، حبة تغلب على الأنسجة، وذلك باستخدام أي حبة الخافق (على سبيل المثال، Biospec) أو ملغام الأسنان (على سبيل المثال، TPC المتقدم<html> تقنيات) مباشرة في المخزن المؤقت تدهور (انظر الخطوة 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البروتين تحضير مجموع استخراج البروتين من خلال وضع الأنسجة الأرض في 500 ميكرولتر من العازلة تدهور [50MM تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgCl 2، 5 ملي DTT، 5 ملي الأدينوزين ثلاثي الفوسفات 5&#39;-، و 1X مثبط البروتياز كوكتيل (سيغما الدريخ)]. علما بأن كوكتيل مثبط البروتياز يؤثر أساسا سيرين، السيستين، الأسبارتيك، وmetalloproteases ولا تتداخل مع البروتيني 26S. توضيح استخراج من قبل اثنين من centrifugations متتابعة في 12،000 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد فعل تدهور البروتين نقل كميات متساوية من مقتطفات، وعادة 20 ميكرولتر، لmicrofuge أنابيب واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لزيادة فترات من الزمن. عادة، والوقت عينة صفر و 5، 10، 15، 20، و 30 نقاط زمنية دقيقة. وقف ردود الفعل من الغليان في هلام SDS عينة العازلة، وتحليلها بواسطة النشاف الغربية. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. الكشف عن تدهور البروتين immunoblotting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هلام الكهربائي 3.1.1 حل عينات البروتين بواسطة SDS-بولكرلميد هلام الكهربائي وelectrotransfer البروتينات العزم على غشاء النيتروسليلوز وفقا لبروتوكول قياسي 30. 3.1.2 تحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة برادفورد (بيو راد)، وتحميل 50-80 ميكروغرام من البروتين الكلي في الممر. تأكد من أن جميع العينات يتم تحميلها على قدم المساواة. لضوابط التحميل، قارن شدة من نوع البروتين في كل مكان، مثل المفترضة RuBisCo السلاسل الكبيرة التي تهاجر والفرقة الكبرى مع التنقل الكهربي النسبي لحوالي 50 كيلو دالتون، بل يمكن أن يتم الكشف عن المواد الهلامية على Coomassie الملطخة الأزرق أو على الشقائقية S-أو الفلورسنت SYPRO روبي الملون والأغشية النيتروسليلوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجب منع الغشاء مع الحليب الخالي من الدسم 5٪ في TBST (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 140 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجسام المضادة الأولية تمييع الابتدائي الأضداد المضادة للحاتمة في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBST إلى التركيز الموصى به من قبل الشركة المصنعة واحتضان مع غشاء حظر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشطف شطف يتم شطف الغشاء في 20 مل TBST لمدة 15 دقيقة مرة واحدة، ومرتين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجسام المضادة الثانوية تمييع الضد الثانوية (على سبيل المثال، مفتش المضادة للأرنب) مترافق مع الفجل البيروكسيداز (HRP) في الحليب الخالي من الدسم 1٪ في TBST على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة واحتضان مع غشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف شطف الغشاء مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.4. بعد شطف النهائي في TBST، تصور البروتينات من الفائدة مع chemiluminescent الركيزة HRP، والأكثر شيوعا باستخدام طقم ECL. </li></ol>

<ol>
	<li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis:+don&#8217;t+Skp+the+F-box+hypothesis.">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don&#8217;t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li><li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+and+cullin/ring+H2-based+ubiquitin+ligases.">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li><li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+in+signaling.">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li><li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+development:+regulation+by+protein+degradation.">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li><li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response.">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li><li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens.">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li><li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling.">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li><li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily.">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li><li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1/2+axis.">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens.">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li><li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein.">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li><li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity.">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium.">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li><li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway.">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li><li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases.">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li><li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism.">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li><li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tome-1,+a+trigger+of+mitotic+entry,+is+degraded+during+G1+via+the+APC.">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li><li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo.">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector.">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li><li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP/Slimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase.">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li><li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSAT+vectors:+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants.">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li><li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units.">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li><li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells.">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome:+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms.">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li><li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin.">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li><li>Ausobel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3/LOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses).">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li></ol>

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

يعتمد هذا الاختبار على التعبير عن البروتينات اختبار في الأنسجة النباتية، وبالتالي، فإن عملية تدهور proteasomal المحتملة الواضح يحدث بالفعل داخل الأنسجة الحية. نحن فحص البروتين زعزعة الاستقرار، ولكن فقط في مقتطفات، مع الوقت عينة الصفر العامل بوصفه نقطة مرجعية أولية. ومن ...

وproteasome ومسار ubiquitin/26S والناشئة باعتبارها آلية على نطاق واسع من أجل السيطرة على التفاعلات البيولوجية المتنوعة، بما في ذلك تنظيم النسخي، خلية دورة التقدم ونقل الإشارة، مستقبلات أسفل تنظيم أو الإلتقام، من بين أمور أخرى بمعالجة 1-4. في هذا المسار، والموسومة البروتين الهدف عن طريق اليوبيكويتين المخلفات التي تعلق الأول عن طريق السندات thiolester لانزيم تفعيل اليوبيكويتين E1 ثم translocated إلى بقايا حمض السيستين الأميني الانزيم اليوبيكويتين-E2 الاقتران، وأخيرا، يتفاعل مع اليوبيكويتين E2 E3 يغاز ، مما أدى إلى polyubiquitination الركيزة البروتين. في نهاية المطاف، يتم التعرف على البروتينات polyubiquitinated والمتدهورة التي proteasome و26S. في هذه الآلية، يحدد الإنزيم E3 الركيزة وتقوم بدور العنصر التنظيمية الرئيسية لنظام proteasome وubiquitin/26S (يو بي إس). يمكن ligases E3 التصرف بشكل مستقل، مثل ligases مجال RING، أو كجزء من SCF multisubunit (Skp1/Cullin/F-box البروتين) المعقدة، مثل ligases مجال F-مربع. وتشارك SCF بوساطة مسارات التحلل proteasomal في تنظيم النسخ، ودورة الخلية، نقل الإشارة 5-10 والعديد من الوظائف الخلوية الرئيسية الأخرى. إلى جانب هذه الأدوار الحاسمة في تنظيم العمليات الخلوية، يو بي إس يأخذ مرحلة مركزية في كثير من التفاعلات النبات الممرض. على سبيل المثال، تشير أدلة متزايدة على أن العديد من مسببات الأمراض النباتية، بما في ذلك الأجرعية المورمة، والاعتماد على UPS المضيفة لتسهيل عملية العدوى 11. الأجرعية يتسبب نمو الأورام على النباتات، والتي تمثل المضيفين الطبيعية، ويمكن أيضا تحويل مجموعة واسعة من حقيقيات النوى الأخرى، من الفطريات 1،2 إلى الخلايا البشرية 12،13. أثناء الإصابة به، الأجرعية تصدر عنصر الحمض النووي (T-DNA) والعديد من الفوعة (فير) البروتينات في الخلية المضيفة 12-13. واحدة من هذه البروتينات هو VirF، أول بروتين F-مربع جدتأن المشفرة بواسطة الجينوم بدائية النواة 14. كجزء من مجمع SCF اليوبيكويتين يغاز، VirF، وجانه الفنية homolog المضيف VBF 15، وتسهيل عدوى الأجرعية عبر شركة يو بي إس تدهور البروتين بوساطة، مما يسهل يفترض uncoating من البكتيريا T-DNA الغازية من المرافق البروتينات في البكتيريا والمضيف، VirE2 وVIP1، على التوالي 16،17. ومن المثير للاهتمام، وكثير من البروتينات F-مربع، بما في ذلك VirF، هي في جوهرها غير مستقرة بسبب التحلل البروتيني الخاصة بهم، والتي يتم بوساطة النشاط autoubiquitination 18،19 أو ligases E3 الأخرى التي البروتينات F-مربع قد تكون بمثابة ركائز 20-23. عند دراسة الأنشطة البيوكيميائية للبروتينات F-مربع، ligases اليوبيكويتين أخرى، و / أو ركائز، وسيكون من المفيد جدا لتوظيف مقايسة بسيطة وموثوق بها لتدهور proteasomal. نحن هنا وصف بروتوكول واحد مثل لتحليل استقرار البروتين في الخليةخالية النظام. في هذا الاختبار، ويتم تحليل استقرار الركيزة يو بي إس في وجود أو عدم وجود واحدة من المكونات الأساسية للتدهور مسار proteasomal، مثل البروتين F-مربع، في نظام خالية من الخلايا. عموما، فإننا نعرب عن البروتين اختبار (ق) في أنسجة النبات، وإعداد مقتطفات خالية من الخلايا من هذه الأنسجة ورصد كميات من البروتين (ق) من الفائدة عن طريق النشاف الغربية. ويتجلى آلية تعتمد على UPS تدهور البروتين عن طريق إدراج مثبطات proteasomal محددة و / أو استخدام coexpression من الشكل السائد السلبية من عنصر SCF، Cullin. بينما نحن لتوضيح هذا الاختبار باستخدام تدهور proteasomal من البروتين نبات الأرابيدوبسيس VIP1 17 من البروتين F-مربع VBF 15، قد تكون استخدمت لتحقيق استقرار أي ركائز proteasomal الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Protein assay kit</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Proteinase inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mini-Protean system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Semi-dry western blotting SD electrotransfer system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td>
			<td style="width:129px;">icllab</td>
			<td>RHGT-45A-Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate</td>
			<td style="width:129px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane</td>
			<td style="width:129px;">Pall Corportation</td>
			<td style="width:119px;">27377-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MG132</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td>474790-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td>
			<td style="width:129px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">35055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying proteasomal degradation in a cell-free system in plants

برز مسار اليوبيكويتين-proteasome وعن تدهور البروتين باعتباره واحدا من أهم الآليات لتنظيم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية في جميع الكائنات الحية حقيقية النواة تقريبا. على وجه التحديد، في النباتات، ونظام proteasome وubiquitin/26S (يو بي إس) ينظم تدهور البروتين ويساهم بشكل كبير في تطوير مجموعة واسعة من العمليات، بما في ذلك الاستجابة المناعية والتنمية وموت الخلية المبرمج. علاوة على ذلك، تشير أدلة متزايدة على أن العديد من مسببات الأمراض النباتية، مثل الأجرعية، استغلال UPS المضيفة للعدوى كفاءة، مع التشديد على أهمية يو بي إس في التفاعلات النبات الممرض. ويتحقق خصوصية ركيزة من يو بي إس من قبل اليوبيكويتين يغاز E3 الذي يعمل بالتنسيق مع E1 و E2 ligases الاعتراف وعلامة جزيئات البروتين محددة متجهة إلى التدهور عن طريق ربط لهم سلاسل من جزيئات اليوبيكويتين. فئة واحدة من ligases E3 هو SCF (Skp1 / Cالبروتين ullin / F-مربع) المعقدة، التي تعترف تحديدا ركائز يو بي اس ويستهدف لهم لubiquitination عبر عنصر البروتين F-علبته. للتحقيق في الدور المحتمل لليو بي إس في عملية بيولوجية من الفائدة، فمن المهم وضع مقايسة بسيطة وموثوق بها لUPS بوساطة تدهور البروتين. هنا، نحن تصف إحدى هذه مقايسة باستخدام نظام خالية من الخلايا النباتية. هذا الاختبار يمكن تكييفها للدراسات أدوار تدهور البروتين في تنظيم العمليات الخلوية المتنوعة، مع التركيز بشكل خاص على F-مربع البروتين الركيزة التفاعلات.

الرقم 1، وتكييفها من Zaltsman آخرون 17، يوضح التجارب ممثل للكشف عن تدهور proteasomal في نظام خالية من الخلايا. على وجه التحديد، ونحن لشرح زعزعة استقرار لالمتعلقة بالدفاع البروتين VIP1 النبات من البروتين F-مربع VBF عبر مسار SCF VBF في N. benthamiana. VBF نبات ...

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants at JoVE.com

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

يمثل استهداف تدهور البروتين آلية تنظيمية كبرى لوظيفة الخلية. يحدث عبر اليوبيكويتين proteasome ومسار الحفظ، والتي تعلق سلاسل polyubiquitin للبروتين الهدف الذي ثم خدمة &quot;العلامات&quot; الجزيئية بالنسبة للproteasome و26S. هنا، نحن تصف مقايسة خالية من الخلايا بسيطة وموثوق بها لتدهور proteasomal البروتينات.

يعاير Proteasomal تدهور في نظام خالية من الخلايا في النباتات

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Views.  Stony Brook University, State University of New York.  يمثل استهداف تدهور البروتين آلية تنظيمية كبرى لوظيفة الخلية. يحدث عبر اليوبيكويتين proteasome ومسار الحفظ، والتي تعلق سلاسل polyubiquitin للبروتين الهدف الذي ثم خدمة "العلامات" الجزيئية بالنسبة للproteasome و26S. هنا، نحن تصف مقايسة خالية من الخ?...

Video: Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

بروتوكولات لتنفيذ و<em&gt; كولاي</em&gt; وبناء خلية الحرة TX-TL نظام التعبير عن علم الأحياء الاصطناعية

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em&gt; القيطم</em&gt; مستخلصات البيض

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

قياس الإيقاعات اليومية في التدفق التلقائي والبروتياسومال

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

بروتوكول بسيط لرسم خرائط سمات بنية نظام جذر النبات

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

القياس الكمي للتسلل الدهني للعضلات الهيكلية عن طريق إزالة الخلايا

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

تسليط الضوء على المؤلف: القياس الكمي القائم على إزالة الخلايا للتسلل الدهني للعضلات الهيكلية  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.