نقدم بروتوكولا للتصور المجهري الإلكتروني للمجالات التكرارية في الخلية عن طريق وضع علامة EdU على الحمض النووي المركب حديثا والكشف عن الملصقات مع تعزيز الفضة لجزيئات Nanogold وتلطيخ ChromEM للكروماتين. يوفر هذا البروتوكول وضع العلامات عالية التباين قبل التضمين مع تثبيت الجلوتارالدهيد التقليدي الذي يوفر أفضل حفظ هيكلي للكروماتين لمعالجة عينات درجة حرارة الغرفة. تم تحسين هذا البروتوكول لخلية الالتصاق التي تنمو على الأغطية في طبق Petri.
أضف EdU إلى 10 مولات صغيرة التركيز النهائي ووضع الخلايا في الحاضنة لوقت وضع العلامات المطلوب. إصلاح الخلايا المصنفة مع 2.5 ٪ gluaradehydrate في محلول كاكوديلات الصوديوم 100 ملليمول لمدة ساعة واحدة. قد يؤثر وقت التثبيت الأطول سلبا على وضع العلامات على EdU.
إزالة الجلوتارالدهيد عن طريق شطف العينات مع PBS تكميل مع خمسة ملليمول من كلوريد المغنيسيوم، ويعتبر كذلك نجم PBS. يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. تخلل أغشية البلازما بمحلول 1٪ من Trione X-100 في نجم PBS ، وقم بإجراء تغييرين لمدة خمس دقائق لكل منهما.
يشار إلى هذا الحل أيضا باسم PBS star T.Wide اغسل العينة بنجم PBS. خمسة تغييرات لمدة خمس دقائق لكل منهما. قم بإخماد مجموعات الألدهيد المتبقية مع 20 ملليمول من الجلايسين في نجم PBS ، مرتين لمدة 10 دقائق.
ضع العينة في نجمة PBS مع 1٪ BSA لمدة نصف ساعة. أثناء الحظر في BSA ، قم بإعداد كوكتيل التفاعل للكشف عن EdU. ترتيب إضافة المكونات مهم.
يتم إجراء اقتران EdU البيوتين-أزيد في الغرفة الرطبة لتقليل التبخر وتحولات التركيز في كوكتيل التفاعل. تحضير الغرفة الرطبة. ضع الغطاء على الطبقة شبه الغشاء مع خلية متجهة لأعلى وطبقة من 50 إلى 100 ميكرولتر من كوكتيل التفاعل على الغطاء.
يستغرق التفاعل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أوقف التفاعل عن طريق غسل العينة في نجم PBS T ، خمس مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. حظر مرة أخرى مع 1٪ BSA في نجم PBS T لمدة نصف ساعة أخرى.
تحضير محلول ستربتافيدين-نانوغولد في PBS نجم T مع 1٪ BSA. احتضان العينة مع الستربتافيدين بين عشية وضحاها في زائد أربع درجات في غرفة رطبة أعدت حديثا. الإجراء هو نفسه كما هو الحال مع اقتران EdU البيوتين-أزيد.
وقف التفاعل وغسل العينة، خمس مرات لمدة 10 دقائق لكل منها مع نجم PBS T.Stabilize البيوتين ستربتافيدين مجمع عن طريق تثبيت إضافي سوف 1٪ غلوتارالدهيد PBS نجم لمدة نصف ساعة. إزالة الجلوتارالدهيد عن طريق الغسيل المكثف بالماء منزوع الأيونات. إخماد مجموعات الألدهيد المتبقية مع ملليغرام واحد لكل ملليلتر بوروهيدريد الصوديوم.
يغسل مرة أخرى جيدا. الخطوة التالية هي زيادة حجم جزيئات Nanogold عن طريق ترسب الفضة على المسار الذهبي. تحضير الخلطات المسبقة لتقليل نشاط الغرفة المظلمة.
قم بموازنة العينات باستخدام مخزن الغسيل المؤقت وانتقل إلى غرفة مظلمة. في الغرفة المظلمة ، امزج المكونات لإعداد محلول الغسيل وتطبيقه على العينات. محلول مسحوق السنط هو اللمحات العالية.
لذلك أثناء خلط المكونات ، قم بهز الأنبوب ببطء لتجنب تكوين الفقاعة والرغوة. يستغرق التفاعل من دقيقتين إلى خمس دقائق. نوصي بإجراء تشغيل تجريبي لتحديد وقت رد الفعل الأمثل.
قد يؤدي وقت الحضانة الأطول إلى ترسب فضة غير محدد. لوقف التفاعل ، اشطف العينة بسرعة مع ثلاثة إلى خمسة تغييرات في الماء منزوع الأيونات. تليها ثلاثة تغييرات أخرى لمدة خمس دقائق لكل منهما.
لحماية جسيمات الفضة النانوية من الذوبان بواسطة رابع أكسيد الأوزميوم ، احتضن العينات في 0.05٪ من حمض رباعي الكلورويوريك لمدة دقيقتين في الظلام. يغسل جيدا بالماء منزوع الأيونات. في هذه المرحلة ، يتم إضافة تباين إضافي إلى المواد التي تحتوي على الحمض النووي.
تشبع العينة بصبغة الحمض النووي DRAQ5. أضف محلول دياميونوبينزيدين إلى العينة واحتضنه لمدة دقيقة واحدة. حرك الغطاء في طبق بتري الزجاجي السفلي ، وضعه على مسرح المجهر المقلوب.
تشعيع العديد من مجالات الرؤية بضوء أحمر 640 نانومتر. تعرض اللوحة اليسرى تبييض الصور بالكامل ل DRAQ5. على اللوحة اليمنى ، يتم تصوير نفس مجال الرؤية في الضوء المرسل الذي يظهر راسب DAB.
اغسل العينات بالماء منزوع الأيونات. يجب تنفيذ المرحلة التالية تحت غطاء الدخان. أعدت جزئيا انخفاض محلول رابع أكسيد الأوزميوم.
انتبه. هذه المادة شديدة التقلب والسمية. ضع المحلول المحضر على العينة.
في هذه المرحلة ، تتفاعل مركبات الأوزميوم المخفضة مع ترسبات دياميونوبينزيدين وتزيد من تباين الحمض النووي. تخلص من محلول يحتوي على الأوزميوم وفقا للوائحك المحلية واغسل العينات ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. يتم تجفيف العينة بشكل أكبر في سلسلة من تركيزات الإيثانول المتزايدة تليها تسلل الخلايا مع مزيج راتنج الإيثانول.
استبدل مزيج راتنج الكحول بالراتنج النقي الطازج. املأ قالب التضمين ذو الحجم المناسب براتنج طازج. ضع الغطاء مع خلية متجهة لأسفل فوق التجويف المملوء بالراتنج.
علاج الراتنج لمدة 24 ساعة في 37 درجة. ثم عند 60 درجة لمدة يومين على الأقل. إزالة الراتنج من السطح السفلي للأغطية.
أسقط البلاطة في نيتروجين سائل ثم انقلها إلى الماء المغلي. يجب فصل الزجاج. كرر ذلك إذا لزم الأمر.
يجب أن تكون مجالات الرؤية المشععة مرئية بوضوح بسبب ترسب دياميونوبينزيدين وتلطيخ DAB. اقطع منطقة الاهتمام من البلاطة باستخدام المنشار أو أي أداة مناسبة أخرى. ضع القاطع في حامل الميكروتوم البسيط.
قم بإعداد ultramicrotome لتشذيب الكتلة النهائية. باستخدام شفرة الحلاقة ، قم بإعداد بيليه على شكل هرم. يجب أن يكون حجم المنطقة المسطحة على قمة الهرم حوالي 400 × 200 ميكرون.
قم بتركيب الهرم المحضر في ذراع ultramicrotome وقم بتثبيت السكين. إعداد الأقسام. يمكن تعديل سمك القسم ليناسب المتطلبات التجريبية.
نحن نهدف إلى التصوير المقطعي EM. لذلك قمنا بإعداد مقاطع بسماكة 250 نانومتر يشار إليها أيضا باسم الأقسام شبه الرقيقة. افصل الأقسام من حافة السكين وقم بتركيبها على شبكة فتحة.
استخدمنا شبكة فتحات ، كانت مستديرة ملليمتر واحد لتكون حولها ، فتحة جانبية ملليمتر واحد. يوفر حجم الفتحة الصغير استقرارا أفضل للأقسام. دع العينات تجف على الشبكة.
في هذه اللحظة ، الأقسام جاهزة للمراقبة. ضع الشبكة في حامل عينة المجهر الإلكتروني. قم بتحميل العينة في المجهر الإلكتروني.
الحصول على سلسلة الإمالة. تعرض بؤر النسخ المتماثل في نوى خلايا الثدييات أنماطا متميزة من التوزيع اعتمادا على تقدم الطور S. يوضح تصنيف EdU الناجح الذي أكده تفاعل النقر باستخدام أزيد المسمى بالفلورسنت نمط النسخ المتماثل النموذجي في مجموعة الخلايا غير المتجانسة بعد تثبيت الجلوتارالدهيد في الأعلى.
يمكن أن يتأثر وضع العلامات على الستربتافيدين بالغوتارالدهيد. لذا تحقق أولا من تلطيخ الستربتافيدين الفلوري تحت نفس حالة الستربتافيدين نانوغولد في القاع. النتيجة الجيدة لإجراء تحسينات الفضة هي تلطيخ بني داكن لبعض النوى وبقعة زرقاء صفراء باهتة للغاية ، كما هو موضح في الأسفل.
ميزة وضع العلامات قبل التضمين هي إمكانية تحديد خلايا للتقسيم. من الممكن في هذه المرحلة لأن أنماط وضع العلامات تصبح مرئية تحت مجهر حقل مشرق. ينتج عن وضع العلامات المناسبة مواقع النسخ المتماثل المحددة جيدا.
يظهر رأس السهم ألياف الكروماتين الملطخة DAB. يقتصر وضع العلامات الخلفية على اليمين على عدد قليل من الجسيمات النانوية لكل ميكرون مربع. الأقسام شبه الرقيقة جاهزة للتصوير المقطعي ولا تتطلب إضافة جسيمات الذهب النانوية.
النهج الموصوف المستخدم في دراسات تنظيم الكروماتين في المواقع ذات النسخ المتماثل الممكن. لتحليل إعادة ترتيب الكروماتين بعد النسخ المتماثل بما في ذلك التصوير عالي الدقة لفصل الكروماتين. كما أنه يستخدم لوضع العلامات المكررة على المجالات الكروموسومية الكبيرة ودراسات طي الكروماتين الأعلى رتبة و heterochromatin.
تقنية التصوير هذه مهمة أيضا كنقطة مرجعية للبيانات الناتجة عن النهج الأخرى غير المجهرية. يمكن أيضا استيعاب هذه الطريقة في الدراسات المجهرية المرتبطة بما في ذلك تقنيات الدقة الفائقة. هذا يفتح آفاقا جديدة في دراسات بنية الكروماتين ذات الترتيب الأعلى وديناميكياتها في الحالات الفسيولوجية المختلفة للخلية.
