Nous présentons un protocole pour la visualisation microscopique électronique des domaines réplicatifs dans la cellule par le marquage EdU de l’ADN nouvellement synthétisé et la détection d’étiquettes avec amélioration de l’argent des particules Nanogold et coloration ChromEM de la chromatine. Ce protocole donne l’étiquetage de pré-intégration à contraste élevé avec la fixation traditionnelle du glutaraldéhyde qui donne la meilleure conservation structurelle de la chromatine pour le traitement de l’échantillon à température ambiante. Ce protocole est optimisé pour la cellule d’adhérence qui se développe sur les couvercles de la boîte de Pétri.
Ajouter EdU à la concentration finale de 10 micro-moles et placer les cellules dans l’incubateur pendant le temps de marquage souhaité. Fixez les cellules marquées avec 2,5% de gluaradehydrate dans une solution de cacodylate de sodium de 100 millimoles pendant une heure. Un temps de fixation plus long peut nuire à l’étiquetage EdU.
Éliminer le glutaraldéhyde en rinçant les échantillons avec du PBS complété par cinq millimoles de chlorure de magnésium, considéré comme une étoile PBS. Laver trois fois pendant 10 minutes. Perméabiliser les membranes plasmiques avec une solution à 1% de Trione X-100 dans l’étoile PBS, effectuer deux changements pendant cinq minutes chacun.
Cette solution est en outre appelée étoile PBS T.Lavez abondamment l’échantillon avec une étoile PBS. Cinq changements pendant cinq minutes chacun. Éteignez les groupes aldéhydes résiduels avec 20 millimoles de glycine dans l’étoile PBS, deux fois pendant 10 minutes.
Placez l’échantillon dans l’étoile PBS avec 1% BSA pendant une demi-heure. Pendant le blocage dans BSA, préparez le cocktail de réaction pour la détection EdU. L’ordre d’ajout des composants est important.
La conjugaison biotine-azoture EdU est effectuée dans la chambre humide pour minimiser l’évaporation et les changements de concentration dans le cocktail réactionnel. Préparez la chambre humide. Placez le couvercle sur le parafilm avec une cellule tournée vers le haut et superposez 50 à 100 microlitres du cocktail de réaction sur le couvercle.
La réaction prend 30 minutes à température ambiante. Arrêtez la réaction en lavant l’échantillon dans l’étoile PBS T, cinq fois pendant cinq minutes chacun. Bloquez à nouveau avec 1% BSA dans l’étoile PBS T pendant une autre demi-heure.
Préparer la solution de streptavidine-Nanogold dans PBS star T avec 1% de BSA. Incuber l’échantillon avec de la streptavidine pendant la nuit à plus quatre degrés dans une chambre humide nouvellement préparée. La procédure est la même qu’avec la conjugaison biotine-azoture EdU.
Arrêtez la réaction et lavez l’échantillon, cinq fois pendant 10 minutes chacun avec l’étoile PBS T.Stabiliser le complexe de biotine streptavidine par fixation supplémentaire va 1% glutaraldéhyde PBS étoile pendant une demi-heure. Éliminer le glutaraldéhyde par lavage intense à l’eau désionisée. Éteindre les groupes aldéhydes résiduels avec un milligramme par millilitre de borohydrure de sodium.
Laver à nouveau soigneusement. La prochaine étape consiste à augmenter la taille des particules de Nanogold au moyen d’un dépôt d’argent sur le parcours d’or. Préparez des prémélanges pour minimiser l’activité de la chambre noire.
Équilibrez les échantillons avec un tampon de lavage et passez à une chambre noire. Dans la chambre noire, mélangez les composants pour préparer la solution de lavage et appliquez-la sur les échantillons. La solution de poudre d’acacia est hautement visiculaire.
Ainsi, lors du mélange des composants, faites basculer le tube lentement pour éviter la formation de bulles et de mousse. La réaction prend de deux à cinq minutes. Nous vous recommandons d’effectuer un test pour déterminer le temps de réaction optimal.
Un temps d’incubation plus long peut entraîner un dépôt d’argent non spécifique. Pour arrêter la réaction, rincez rapidement l’échantillon avec trois à cinq changements de l’eau désionisée. Suivi de trois autres changements pendant cinq minutes chacun.
Pour protéger les nanoparticules d’argent de la dissolution par le tétroxyde d’osmium, incuber les échantillons dans de l’acide tétrachloroaurique à 0,05% pendant deux minutes dans l’obscurité. Laver soigneusement à l’eau désionisée. À ce stade, un contraste supplémentaire est ajouté au matériau contenant de l’ADN.
Saturer l’échantillon avec une coloration d’ADN DRAQ5. Ajouter la solution de diamionobenzidine à l’échantillon et incuber pendant une minute. Déplacez le couvercle dans la boîte de Petri inférieure en verre et placez-le sur la scène du microscope inversé.
Irradier plusieurs champs de vision avec une lumière rouge de 640 nanomètres. Le panneau de gauche montre le blanchiment photo complet de DRAQ5. Sur le panneau de droite, le même champ de vision est imagé dans la lumière transmise montrant le précipité DAB.
Laver les échantillons avec de l’eau désionisée. L’étape suivante doit être effectuée sous la hotte. Préparation d’une solution de tétroxyde d’osmium partiellement réduite.
Fais attention. Cette substance est très volatile et toxique. Appliquer la solution préparée sur l’échantillon.
À ce stade, les composés d’osmium réduits réagissent avec les dépôts de diamionobenzidine et augmentent le contraste de l’ADN. Éliminez la solution contenant de l’osmium conformément à votre réglementation locale et lavez les échantillons trois fois pendant cinq minutes chacun. L’échantillon est ensuite déshydraté dans une série de concentrations croissantes d’éthanol suivies de l’infiltration des cellules avec des mélanges de résine d’éthanol.
Remplacez le mélange de résine d’alcool par de la résine pure fraîchement préparée. Remplissez le moule d’encastrement de taille appropriée avec une résine fraîchement préparée. Placez le couvercle avec une cellule tournée vers le bas au-dessus de la cavité remplie de résine.
Durcir la résine pendant 24 heures à 37 degrés. Puis à 60 degrés pendant au moins deux jours. Retirez la résine d’une surface inférieure d’un couvercle.
Déposer la dalle dans un azote liquide, puis transférer dans de l’eau bouillante. Le verre doit se détacher. Répétez l’opération si nécessaire.
Les champs de vision irradiés doivent être clairement visibles en raison du dépôt de diamionobenzidine et de la coloration DAB. Découpez la zone d’intérêt de la dalle à l’aide de la scie à métaux ou de tout autre instrument approprié. Placez la découpe dans le support simple ultramicrotome.
Configurez l’ultramicrotome pour le rognage final du bloc. À l’aide de la lame de rasoir, préparez le pilulier en forme de pyramide. La taille d’une zone plate au sommet de la pyramide devrait être d’environ 400 par 200 microns.
Montez la pyramide préparée dans le bras ultramicrotome et installez le couteau. Préparez les sections. L’épaisseur de la section peut être ajustée pour répondre aux exigences expérimentales.
Nous visons la tomographie EM. Nous avons donc préparé des sections d’une épaisseur de 250 nanomètres, également appelées sections semi-minces. Détachez les sections du bord du couteau et montez-les sur une grille de fente.
Nous avons utilisé une grille de fentes, elles étaient rondes d’un millimètre pour être autour, une ouverture latérale d’un millimètre. La petite taille d’ouverture offre une meilleure stabilité des sections. Laissez les échantillons sécher sur la grille.
En ce moment, les sections sont prêtes pour l’observation. Placez la grille dans le porte-échantillon du microscope électronique. Chargez l’échantillon dans le microscope électronique.
Acquérir la série tilt. Les foyers de réplication dans les noyaux de cellules de mammifères présentent des modèles de distribution distincts en fonction de la progression de la phase S. Le marquage réussi de l’EdU confirmé par la réaction de clic avec de l’azoture marqué par fluorescence démontre un schéma de réplication typique dans la population cellulaire hétérogène après fixation du glutaraldéhyde sur le dessus.
Le marquage de la streptavidine peut être influencé par le glutaraldéhyde. Vérifiez donc d’abord la coloration à la streptavidine de fluorescence dans les mêmes conditions que la streptavidine nanogold sur le fond. Le bon résultat de la procédure d’amélioration de l’argent est une coloration brun foncé de certains noyaux et une tache de cytoplaste jaune très faible, montrée sur le fond.
L’avantage d’un étiquetage de pré-intégration est la possibilité de sélectionner des cellules pour le sectionnement. C’est possible à ce stade car les motifs d’étiquetage deviennent visibles sous un microscope à champ lumineux. L’étiquetage approprié permet d’obtenir les sites de réplication bien délimités.
Arrowhead montre les fibres de chromatine colorées DAB. L’étiquetage de fond à droite est limité à quelques nanoparticules par micron carré. Les sections semi-minces sont prêtes pour la tomographie et ne nécessitent pas l’ajout de nanoparticules d’or.
L’approche décrite utilisée pour les études de l’organisation de la chromatine sur des sites avec réplication activée. Pour l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine, y compris l’imagerie à haute résolution de la ségrégation de la chromatine. Il est également utilisé pour le marquage répliqué de grands domaines chromosomiques et les études du repliement de la chromatine d’ordre supérieur et de l’hétérochromatine.
Cette technique d’imagerie est également importante comme point de référence pour les données générées par d’autres approches non microscopiques. La méthode peut également être intégrée dans des études microscopiques corrélées, y compris des techniques de super résolution. Cela ouvre de nouveaux horizons dans l’étude de la structure d’ordre supérieur de la chromatine et de sa dynamique dans les différents états physiologiques de la cellule.
