Presentamos un protocolo para la visualización microscópica electrónica de los dominios replicativos en la célula mediante el etiquetado EdU del ADN recién sintetizado y la detección de etiquetas con mejora de plata de partículas de Nanogold y tinción ChromEM de la cromatina. Este protocolo proporciona el etiquetado de preincrustación de alto contraste con fijación tradicional de glutaraldehído que proporciona la mejor preservación estructural de la cromatina para el procesamiento de muestras a temperatura ambiente. Este protocolo está optimizado para la adherencia celular que crece en las cubiertas de la placa de Petri.
Agregue EdU a la concentración final de 10 micro moles y coloque las células en la incubadora durante el tiempo de etiquetado deseado. Fije las células marcadas con 2.5% de gluaradehidrato en una solución de cacodilato de sodio de 100 milimoles durante una hora. Un tiempo de fijación más largo puede afectar negativamente al etiquetado de EdU.
Elimine el glutaraldehído enjuagando las muestras con PBS suplementado con cinco milimoles de cloruro de magnesio, considerado además como PBS star. Lavar tres veces durante 10 minutos. Permeabilizar las membranas plasmáticas con una solución al 1% de Trione X-100 en PBS star, realizar dos cambios durante cinco minutos cada uno.
Esta solución se conoce además como PBS star T.Lave ampliamente la muestra con PBS star. Cinco cambios durante cinco minutos cada uno. Apague los grupos aldehídos residuales con 20 milimoles de glicina en la estrella PBS, dos veces durante 10 minutos.
Coloque la muestra en PBS star con 1% BSA durante media hora. Mientras bloquea en BSA, prepare el cóctel de reacción para la detección de EdU. El orden de adición de los componentes es importante.
La conjugación biotina-azida de EdU se realiza en la cámara húmeda para minimizar la evaporación y los cambios de concentración en el cóctel de reacción. Prepare la cámara húmeda. Coloque el coverslip en la parapelícula con las células hacia arriba y coloque de 50 a 100 microlitros del cóctel de reacción en el coverslip.
La reacción tarda 30 minutos a temperatura ambiente. Detenga la reacción lavando la muestra en PBS estrella T, cinco veces durante cinco minutos cada una. Bloquee de nuevo con 1% BSA en PBS estrella T durante otra media hora.
Preparar la solución de estreptavidina-Nanogold en PBS estrella T con 1%BSA. Incubar la muestra con estreptavidina durante la noche a más cuatro grados en una cámara húmeda recién preparada. El procedimiento es el mismo que con la conjugación biotina-azida EdU.
Detenga la reacción y lave la muestra, cinco veces durante 10 minutos cada una con PBS estrella T.Estabilizar el complejo de estreptavidina de biotina mediante una fijación adicional del 1% de glutaraldehído PBS estrella durante media hora. Eliminar el glutaraldehído mediante un lavado intenso con agua desionizada. Apague los grupos aldehído residual con un miligramo por mililitro de borohidruro de sodio.
Lavar de nuevo a fondo. El siguiente paso es aumentar el tamaño de las partículas de Nanogold por medio de la deposición de plata en el curso de oro. Prepare premezclas para minimizar la actividad en el cuarto oscuro.
Equilibre las muestras con el tampón de lavado y proceda a un cuarto oscuro. En el cuarto oscuro mezclar los componentes para preparar la solución de lavado y aplicarla a las muestras. La solución de polvo de acacia es altamente visible.
Por lo tanto, durante la mezcla de los componentes, balancee el tubo lentamente para evitar la formación de burbujas y espuma. La reacción dura de dos a cinco minutos. Recomendamos realizar una prueba para determinar el tiempo de reacción óptimo.
Un tiempo de incubación más largo puede resultar en una deposición de plata inespecífica. Para detener la reacción, enjuague rápidamente la muestra con tres a cinco cambios del agua desionizada. Seguido de tres cambios más durante cinco minutos cada uno.
Para proteger las nanopartículas de plata de la disolución por el tetróxido de osmio, incube las muestras en ácido tetracloroáurico al 0,05% durante dos minutos en la oscuridad. Lavar bien con agua desionizada. En esta etapa, se agrega contraste adicional al material que contiene ADN.
Saturar la muestra con tinción de ADN DRAQ5. Agregue la solución de diamionobenzidina a la muestra e incube durante un minuto. Mueva el cubrehojas en la placa de Petri con fondo de vidrio y colóquelo en el escenario del microscopio invertido.
Irradia varios campos de visión con luz roja de 640 nanómetros. El panel izquierdo muestra el blanqueamiento fotográfico completo de DRAQ5. En el panel derecho, el mismo campo de visión se visualiza en la luz transmitida que muestra el precipitado DAB.
Lavar las muestras con agua desionizada. La siguiente etapa debe realizarse bajo el capó de humos. Preparado solución de tetróxido de osmio parcialmente reducida.
Ten cuidado. Esta sustancia es altamente volátil y tóxica. Aplique la solución preparada sobre la muestra.
En esta etapa, los compuestos reducidos de osmio reaccionan con las deposiciones de diamionobencidina y aumentan el contraste del ADN. Deseche la solución que contiene osmio de acuerdo con su regulación local y lave las muestras tres veces durante cinco minutos cada una. La muestra se deshidrata aún más en una serie de concentraciones crecientes de etanol seguidas de la infiltración de las células con mezclas de resina de etanol.
Reemplace la mezcla de resina alcohólica con resina pura recién preparada. Llene el molde de incrustación del tamaño adecuado con una resina recién preparada. Coloque el trozo de cubierta con una celda hacia abajo sobre la cavidad llena de resina.
Curar la resina durante 24 horas a 37 grados. Luego a 60 grados durante al menos dos días. Retire la resina de la superficie inferior de una cubierta.
Deje caer la losa en un nitrógeno líquido y luego transfiérala al agua hirviendo. El vidrio debe desprenderse. Repita si es necesario.
Los campos de visión irradiados deben ser claramente visibles debido a la deposición de diamionobencidina y la tinción de DAB. Recorte el área de interés de la losa utilizando la sierra o cualquier otro instrumento adecuado. Coloque el recorte en el soporte simple ultramicrotomo.
Configure el ultramicrotomo para el recorte final del bloque. Usando la hoja de afeitar, prepare el pasto en forma de pirámide. El tamaño de un área plana en la parte superior de la pirámide debe ser de aproximadamente 400 por 200 micras.
Monte la pirámide preparada en el brazo del ultramicrotomo e instale el cuchillo. Preparar las secciones. El grosor de la sección se puede ajustar para adaptarse a los requisitos experimentales.
Nuestro objetivo es la tomografía EM. Así que preparamos secciones con un espesor de 250 nanómetros también conocidas como secciones semidelgadas. Separe las secciones del filo de la navaja y móntelas en una rejilla de ranura.
Usamos una rejilla de ranura, eran redondas de un milímetro para estar alrededor, una abertura lateral de un milímetro. El pequeño tamaño de apertura proporciona una mejor estabilidad de las secciones. Deje que las muestras se sequen en la rejilla.
En este momento, las secciones están listas para la observación. Coloque la rejilla en el soporte de muestra del microscopio electrónico. Cargue la muestra en el microscopio electrónico.
Adquirir series basculantes. Los focos de replicación en los núcleos celulares de mamíferos muestran distintos patrones de distribución dependiendo de la progresión de la fase S. El etiquetado exitoso de EdU confirmado por la reacción de clic con azida marcada fluorescentemente demuestra el patrón de replicación típico en la población celular heterogénea después de la fijación de glutaraldehído en la parte superior.
El etiquetado de la estreptavidina puede ser influenciado por el glutaraldehído. Así que primero verifique la tinción de estreptavidina de fluorescencia en la misma condición que el nanooro de estreptavidina en la parte inferior. El buen resultado del procedimiento de mejoras de plata es una tinción marrón oscuro de algunos núcleos y una mancha de citotrito amarillo muy débil, que se muestra en la parte inferior.
La ventaja de un etiquetado de preincrustación es la posibilidad de seleccionar celdas para la sección. Es posible en esta etapa porque los patrones de etiquetado se vuelven visibles bajo un microscopio de campo brillante. El etiquetado apropiado da como resultado los sitios de replicación bien demarcados.
La punta de flecha muestra las fibras de cromatina teñidas de DAB. El etiquetado de fondo a la derecha está limitado a unas pocas nanopartículas por micra cuadrada. Las secciones semidelgadas están listas para la tomografía y no requieren la adición de nanopartículas de oro.
El enfoque descrito utilizado para los estudios de organización de la cromatina en sitios con replicación habilitada. Para el análisis del reordenamiento post replicativo de la cromatina, incluidas las imágenes de alta resolución de la segregación de cromatina. También se utiliza para el etiquetado replicado de grandes dominios cromosómicos y estudios de plegamiento de cromatina de orden superior y heterocromatina.
Esta técnica de imagen también es importante como punto de referencia para los datos generados por otros enfoques no microscópicos. El método también se puede acomodar en estudios microscópicos correlacionados, incluidas las técnicas de súper resolución. Esto abre nuevos horizontes en los estudios de la estructura de orden superior de la cromatina y su dinámica en los diversos estados fisiológicos de la célula.
