داخل الأجنة، تتفاعل الخلايا مع بعضها البعض، وتبادل المعلومات الكيميائية والميكانكية. إحدى الطرق الفعالة للتحقيق في هذه التفاعلات هي قتل بعض الخلايا ورصد العواقب على الخلايا المجاورة. الطريقة التي نصفها تسمح لنا بمحض الخلايا بدقة، حتى داخل الجنين، دون الإضرار بالأنسجة المجاورة.
قم بإعداد مجهر الفوتونين من خلال ضبط الليزر الأول على الطول الموجي للاجتثاث 820 نانومتر، والليزر الثاني إلى الطول الموجي للتصوير mCherry 1، 160 نانومتر. باستخدام المرايا المنقولة على المسار البصري، ومحاذاة شعاعي الليزر عند دخول وخروج رؤساء المسح الضوئي، ثم قياس الطاقة القصوى لليزر الأول في 820 نانومتر. ضع عداد الطاقة تحت الهدف، وأغلق الغرفة السوداء، وحدد طاقة الليزر الأولى إلى 100٪ ابدأ جمع البيانات على مقياس الطاقة، وفتح مصراع الليزر ثم قياس قوة الإخراج وحساب النسبة المئوية لطاقة الليزر اللازمة للوصول إلى 300 ملليواط.
تعيين الليزر الأول إلى الطول الموجي GFP الإثارة من 920 نانومتر والطاقة إلى 7٪ ضبط طاقة الليزر الثانية إلى 15٪ تنشيط كاشفات PMT للخطوط الخضراء والحمراء، وتعيين حساسية PMT الخط الأخضر والأحمر إلى 65. ضبط مجال الرؤية إلى 400 في 400 ميكرومتر، ودقة الصورة إلى 512 في 512 بكسل، وتردد المسح الضوئي إلى 800 هيرتز. حدد وضع التصوير الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد، ثم أنشئ مجلدا وقم بتنشيط الحفظ التلقائي لحفظ البيانات بعد كل عملية استحواذ.
تجميع غرفة التدفئة وتعيينها إلى 28 درجة مئوية. انتظر ما لا يقل عن 10 دقائق للغرفة والهدف من ذلك إلى الحارة. تحت منظار مجسم مفلور، حدد الأجنة بنسبة 70٪ من البشرة التي تعبر عن GFP.
و, باستخدام ماصة باستور البلاستيك, نقل ثلاثة إلى أربعة أجنة مختارة في طبق المغلفة agarose و dechorionate بعناية لهم مع ملقط غرامة. في قارورة زجاجية صغيرة، أضف ملليلتر واحد من محلول من بينسلين-ستربتوميسين الجنين المتوسطة التي تحتوي على 2٪agarose، ووضع القارورة في سخان كتلة جافة مسخنة مسبقا في 42 درجة مئوية. باستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار ، قم بنقل جنين مهتبس إلى القارورة ، مع الحرص على عدم إضافة الكثير من وسيط الجنين إلى الآغروز.
تجاهل المتوسط الجنين المتبقية من ماصة. يستنشق الجنين مرة أخرى، جنبا إلى جنب مع ما يكفي من الآغاروز لتغطية الشريحة من طبق أسفل الزجاج. قم بتفجير الآغاروز مع الجنين على الشريحة الزجاجية للطبق ، مما يضمن عدم لمس الجنين للهواء أو الجانب البلاستيكي من الطبق.
ثم، ملء الغرفة حول الشريحة الزجاجية مع agarose. باستخدام رمش، وتوجيه الجنين بحيث تكون المنطقة المستهدفة في الجزء العلوي. بعد خمس دقائق، عندما يتم تعيين agarose تماما، إضافة بضع قطرات من البنسلين-streptomycin الجنين المتوسطة إلى الشريحة الزجاجية.
ضع طبق القاع الزجاجي تحت الهدف في الغرفة الساخنة. تزج الهدف في المتوسطة الجنين البنسلين-streptomycin قبل إغلاق الغرفة. حرك شريط التمرير لتعيين مسار الضوء إلى العينين.
تشغيل مصباح الفلورسينس. العثور على الجنين وتعيين التركيز على سطحه. قم بإيقاف تشغيل المصباح الفلوري وحدد مسار الضوء إلى PMTs قبل إغلاق الغرفة السوداء.
بدء التصوير الحي وتحديد موقع mesoderm المحورية. للحصول على إشارة جيدة، قم بضبط قوى الليزر. استخدم القناة الحمراء لنقل المرحلة إلى أعلى الجنين، وقم بتعيين هذا الموضع على أنه Z يساوي صفرا.
اختر خطوة زمنية دقيقة واحدة وخطوة Z من ميكرومترين. تعيين الشريحة الأولى في 15 ميكرومتر فوق mesoderm المحوري، والشريحة الأخيرة في 15 ميكرومتر تحت mesoderm المحوري. سجل 10 إلى 15 دقيقة من فيلم ما قبل الاستئصال.
على التصوير الحي، حدد موقع كفاف بولستر، ثم، وذلك باستخدام المنطقة المغير الكهربائي البصري من الفائدة، أو أداة EOM-ROI، رسم مستطيل 20 بكسل كبيرة التي تمتد عرض بولستر، ووضع المستطيل في منتصف بولستر. لاحظ الموضع المحوري للطائرات الأعلى والأدنى التي سيتم اجتثاثها ، مما يضمن عدم تداخل عائد الاستثمار مع خلية الصفار على أي من الطائرات. ضع المرحلة في أدنى وضع Z ليتم اجتثاثها.
تعيين الطول الموجي ليزر الأول إلى 820 نانومتر وأدخل نسبة الطاقة كما حسبت في وقت سابق للحصول على قوة الخروج من 300 مللي واط. تعيين تردد التصوير إلى 200 هيرتز وأول تصوير ليزر EOM إلى الصفر. بعد تحديد وضع علاج عائد الاستثمار، قم بإيقاف تشغيل EOM، ثم قم بتعيين المعالجة لبدء التشغيل مباشرة بعد الإطار الصفري.
وضع وضع التصوير إلى الفاصل الزمني وتعطيل الحفظ التلقائي. بعد تحديد الوضع السريع في الخطوة الزمنية، قم بضبط عدد إطارات المعالجة وعدد الإطارات إلى القيمة المقابلة للعمق المستهدف. بدء التصوير.
يجب أن يكون الاستحواذ أسود ، حيث يغلق الغالق إلى PMT أثناء علاج EOM. بعد ذلك ، انتقل إلى أعلى المسرح إلى وضع Z التالي ، وبالمثل قم بإجراء الاستئصال. كرر على كل موقف Z حتى يتم التوصل إلى الجزء العلوي من بولستر.
عند اكتمال عملية الاستئصال، قم بضبط أول ليزر على 920 نانومتر واضبط على قوة التصوير التي تم اختيارها مسبقا. وضع أول التصوير بالليزر EOM إلى 100 واختيار وضع الحقل الكامل. يجب أن يكون تردد التصوير 800 هيرتز، وينبغي إيقاف EOM قبل فحص المكدس بأكمله في الوضع المباشر للتحقق مما إذا كان قد تم استئصال كل طائرة.
بمجرد تأكيد الاستئصال، حدد الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد كوضع التصوير. إعادة تنشيط الحفظ التلقائي، وبدء تسجيل فيلم ما بعد الاستئصال لمدة 40 إلى 60 دقيقة. في فيلم ما بعد الاستئصال، تحقق مما إذا كانت الخلايا المستهدفة قد تم استئصالها بشكل فعال.
كما الاستئصال عبر polsters لا ينبغي أن تضر الأجنة، يمكن ملاحظة مورفولوجيا طبيعية من الأجنة المبلد في 24 ساعة بعد الإخصاب. في النتيجة الناجحة للاجتثاث بالليزر ، لم تتأثر الأنسجة المتراكبة باجتثاث الهياكل الأساسية. أدى العلاج المكثف للغاية ، أو القليل جدا من العلاج ، إلى فشل في استئصال الليزر.
مثال على الاستئصال غير الناجح يظهر الخلايا فوق بولستر يجري ablated، وهو ما كان واضحا من الحطام autofluorescent في الطائرة المحورية فوق بولستر. وفي محاولة أخرى غير فعالة، تم تبييض الخلايا ولكن ليس اجتثاثها، ولا تزال الإشارات الفلورية المنخفضة تكشف عن ملامح الخلية السليمة. وأخيرا، لم يتم حتى تبييض بعض الخلايا بسبب عدم كفاية العلاج بالليزر.
يرجع تكوين الفقاعات إلى التجويف الناجم عن علاج ليزر مكثف للغاية. تم التقاط مداخن Z كل دقيقة لمدة 40 دقيقة في استئصال ناجح ، وتسجيل كل من GFP السيتوبلازمية وإشارات mCherry النووية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وضع علامة على النوى التي تنتمي إلى النصف الأمامي من البولستر بنقطة أرجوانية وتتبعها بمرور الوقت ، قبل وبعد الاستئصال.
وكمقياس لاستمرار الهجرة، تمت دراسة الارتباط التلقائي اتجاه الخلايا قبل وبعد الاستئصال. وأظهرت الخلايا التي تنتمي إلى الجزء الأمامي من بولستر حركة مستمرة قبل الاستئصال، والتي تنخفض بشكل كبير بعد الاستئصال، مما يشير إلى فقدان الهجرة الجماعية الموجهة. محاذاة الليزر بشكل صحيح وقياس قوة الليزر أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ.
كما أنه من المهم التحقق من كفاءة الاستئصال في الصور الأولى بعد الاجتثاث. نحن نستخدم عمليات الاستئصال بالليزر للتشكيك في دور التفاعلات بين الخلايا في توجيه هجرة الخلايا داخل الجنين. ولكن يمكن تكييف الإجراء بسهولة مع العديد من الأسئلة الأخرى حيث تحتاج الخلايا أو الأنسجة إلى الاجتثاث بدقة ، وربما عميقة في الكائن الحي.
