Embriyolar içinde hücreler birbirleriyle etkileşime girerek kimyasal ve mekanik bilgi alışverişinde bulunurlar. Bu etkileşimleri kontrol etmenin etkili bir yolu, bazı hücreleri öldürmek ve komşu hücreler üzerindeki sonuçları izlemektir. Tarif ettiğimiz yöntem, komşu dokulara zarar vermeden embriyo içinde bile hücreleri doğru bir şekilde alevlendirmemizi sağlar.
İlk lazeri ablasyon dalga boyu 820 nanometreye, ikinci lazeri de mCherry görüntüleme dalga boyu 1.160 nanometreye ayarlayarak iki foton mikroskobu hazırlayın. Optik yolda hareketli aynalar kullanarak, tarama kafaları giriş ve çıkışındaki iki lazer ışınını hizalayın, ardından ilk lazerin maksimum gücünü 820 nanometrede ölçün. Güç ölçeri hedefin altına yerleştirin, siyah odayı kapatın ve ilk lazer gücünü %100'e ayarlayın Güç ölçerde veri toplamayı başlatın, lazer deklanşörini açın, ardından çıkış gücünü ölçün ve 300 miliwatt'a ulaşmak için gereken lazer gücünün yüzdesini hesaplanın.
İlk lazeri 920 nanometre GFP heyecan dalga boyunu ve gücü %7 olarak ayarlayın İkinci lazer gücünü %15'e ayarlayın Pmt dedektörlerini yeşil ve kırmızı çizgiler için etkinleştirin ve yeşil ve kırmızı çizgi PMT hassasiyetini 65 olarak ayarlayın. Görüş alanını 400 x 400 mikrometreye, görüntü çözünürlüğünü 512 x 512 piksele ve tarama frekansını 800 hertz'ye ayarlayın. 3D zaman atlamalı görüntüleme modunu seçin, ardından bir klasör oluşturun ve her alımdan sonra verileri kaydetmek için Otomatik Kaydet'i etkinleştirin.
Isıtma odasını monte edin ve 28 santigrat dereceye ayarlayın. Odanın ve hedefin ısınması için en az 10 dakika bekleyin. Floresan stereomikroskop altında, embriyoları GFP'yi ifade eden %70 epiboly olarak tanımlayın.
Plastik bir Pasteur pipet kullanarak, agarose kaplı tabakta üç ila dört seçilmiş embriyoyu aktarın ve ince önlüklerle dikkatlice kaynatın. Küçük bir cam şişeye, %2 agarose içeren penisilin-streptomisilin embriyo ortamı çözeltisinin mililitresini ekleyin ve şişeyi 42 santigrat derecede önceden ısıtılmış, kuru blok ısıtıcıya yerleştirin. Ateş cilalı bir cam pipet kullanarak, agarose'a çok fazla embriyo ortamı eklememeye dikkat ederek, kafeinsiz bir embriyoyu şişeye aktarın.
Kalan embriyo ortamını pipetten atın. Embriyoyu, cam alt kabın kaydıramasını örtecek kadar agarose ile birlikte geripirat. Agarose'yi embriyo ile yemeğin cam kaydırağı üzerine üfleyin, embriyonun havaya veya yemeğin plastik tarafına dokunmamasını sağlayın.
Ardından, cam kaydırağın etrafındaki odayı agarose ile doldurun. Kirpik kullanarak embriyoyu hedeflenen bölgenin en üstünde olacak şekilde yönlendirin. Beş dakika sonra, agarose tamamen ayarlandığında, cam kaydırağa birkaç damla penisilin-streptomisin embriyo ortamı ekleyin.
Cam alt kabı ısıtılmış hazneye hedefin altına yerleştirin. Odayı kapatmadan önce hedefi penisilin-streptomisinin embriyo ortamına daldır. Işık yolunu oküler olarak ayarlamak için kaydırıcıyı hareket ettinin.
Floresan lambayı açın. Bir embriyo bulun ve odağı yüzeyine ayarlayın. Floresan lambayı kapatın ve siyah odayı kapatmadan önce ışık yolunu PMT'lere ayarlayın.
Canlı görüntülemeye başlayın ve eksenel mezodermi bulun. İyi bir sinyale sahip olmak için lazer güçlerini ayarlayın. Aşamayı embriyonun en üstüne taşımak için kırmızı kanalı kullanın ve bu pozisyonu Z sıfıra eşit olarak atayın.
Bir dakikalık bir zaman adımı ve iki mikrometreden oluşan bir Z adımı seçin. İlk dilimi eksenel mezodermden 15 mikrometre, son dilimi ise eksenel mezoderm'in 15 mikrometre altına ayarlayın. Bir ablasyon öncesi filmin 10 ila 15 dakikasını kaydedin.
Canlı görüntülemede, polster konturunun yerini tespit edin, ardından, ilgi çekici elektro-optik modülatör bölgesini veya EOM-ROI aracını kullanarak, polster'ın genişliğini kapsayan 20 piksel genişliğinde bir dikdörtgen çizin ve dikdörtgeni polster'ın ortasına yerleştirin. Tütsülenecek en yüksek ve en düşük düzlemlerin eksenel konumuna dikkat edin, yatırım getirisinin düzlemlerin hiçbirinde yumurta sarısı hücresiyle çakışmamasını sağlayın. Sahneyi ablatlanacak en düşük Z konumuna getirin.
İlk lazer dalga boyunun 820 nanometreye ayarla ve 300 miliwatt çıkış gücü elde etmek için daha önce hesaplandıkça güç yüzdesini girin. Görüntüleme frekansını 200 hertz ve ilk lazer görüntüleme EOM'yi sıfıra ayarlayın. Yatırım getirisi tedavi modunu seçtikten sonra, EOM'yi kapatın ve tedaviyi sıfır kareden hemen sonra başlayacak şekilde ayarlayın.
Görüntüleme modunu Timelapse'e getirin ve Otomatik Kaydetme'yi devre dışı bırakın. Zaman adımında Hızlı modu seçtikten sonra, tedavi çerçevelerinin sayısını ve kare sayısını hedeflenen derinliğe karşılık gelen değere ayarlayın. Görüntülemeye başlayın.
EOM tedavisi sırasında PMT deklanşörü kapanacağından satın alma siyah olmalıdır. Ardından, sahneyi bir sonraki Z konumuna getirin ve benzer şekilde ablasyon gerçekleştirin. Polster'ın tepesine ulaşılana kadar her Z pozisyonunda tekrarlayın.
Ablasyon işlemi tamamlandığında, ilk lazeri 920 nanometreye ayarlayın ve daha önce seçilen görüntüleme gücüne ayarlayın. İlk lazer görüntüleme EOM'yi 100'e getirin ve Tam alan modunu tercih edin. Görüntüleme sıklığı 800 hertz olmalı ve her düzlemin ablatlanıp ablatlanmadığını kontrol etmek için tüm yığını canlı modda incelemeden önce EOM kapatılmalıdır.
Ablasyon onaylandıktan sonra, görüntüleme modu olarak 3B Zaman atlamalı'yı seçin. Otomatik Kaydetme'yi yeniden etkinleştirin ve 40 ila 60 dakika boyunca ablasyon sonrası filmi kaydetmeye başlayın. Ablasyon sonrası filmde, hedeflenen hücrelerin etkili bir şekilde ablatlanıp ablatlanmadığını kontrol edin.
Polsterler boyunca ablasyonlar embriyolara zarar vermemelidir, ablated embriyoların normal morfolojisi döllenme sonrası 24 saate kadar gözlenebilir. Lazer ablasyonların başarılı sonuçlarında, üst üste binen dokular alttaki yapıların ablasyonundan etkilenmedi. Çok yoğun bir tedavi veya çok az tedavi, lazer ablasyonda başarısızlıklara neden oldu.
Başarısız ablasyon örneği, polster'ın üzerindeki hücrelerin, polsterin üzerindeki odak düzleminde otoflüoresan döküntülerle belirgin olan ablated olduğunu göstermektedir. Başka bir etkisiz girişimde, hücreler ağartıldı, ancak ablated değildi ve düşük floresan sinyalleri hala sağlam hücre hatlarını ortaya koyuyor. Son olarak, yetersiz lazer tedavisi nedeniyle bazı hücreler ağartılmış bile değildi.
Kabarcıkların oluşumu, çok yoğun bir lazer tedavisinin neden olduğu kavitasyondan kaynaklanmaktadır. Z yığınları, hem sitoplazmik GFP hem de nükleer mCherry sinyallerini kaydeden başarılı bir ablasyonda 40 dakika boyunca her dakika yakalandı. Ek olarak, polster'ın ön yarısına ait çekirdekler bir macenta noktası ile işaretlenir ve zamanla, ablasyondan önce ve sonra izlenir.
Göç kalıcılığının bir ölçüsü olarak, ablasyon öncesi ve sonrası hücrelerin yön otomatik korelasyonu çalışılmıştır. Polster'ın ön kısmına ait hücreler, ablasyondan önce kalıcı bir hareket gösterdi, bu da ablasyondan sonra büyük ölçüde azalır ve bu da kolektif yönelimli göç kaybını gösterir. Lazerlerin düzgün bir şekilde hizalaması ve lazer gücünün ölçülmesi, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir.
Ayrıca, ablasyon sonrası ilk görüntülerde ablasyon verimliliğini kontrol etmek de önemlidir. Embriyo içindeki hücrelerin göç etmesine rehberlik eden hücre-hücre etkileşimlerinin rolünü sorgulamak için lazer ablasyonları kullanıyoruz. Ancak prosedür, hücrelerin veya dokuların organizmanın derinliklerinde tam olarak ablatılması gereken diğer birçok soruya kolayca uyarlanabilir.
