Dentro de los embriones, las células interactúan entre sí, intercambiando información química y mecánica. Una forma eficiente de sondear estas interacciones es matar algunas células y monitorear las consecuencias en las células vecinas. El método que describimos nos permite extirpar con precisión las células, incluso dentro del embrión, sin dañar los tejidos vecinos.
Prepare el microscopio de dos fotones ajustando el primer láser a la longitud de onda de ablación de 820 nanómetros, y el segundo láser a la longitud de onda de imagen mCherry 1, 160 nanómetros. Usando espejos móviles en la trayectoria óptica, alinee los dos rayos láser en los cabezales de escaneo de entrada y salida, luego mida la potencia máxima del primer láser a 820 nanómetros. Coloque el medidor de potencia debajo del objetivo, cierre la cámara negra y configure la primera potencia láser al 100% Inicie la recopilación de datos en el medidor de potencia, abra el obturador láser y luego mida la potencia de salida y calcule el porcentaje de potencia láser necesaria para alcanzar los 300 milivatios.
Ajuste el primer láser a la longitud de onda de excitación GFP de 920 nanómetros y la potencia al 7%Ajuste la segunda potencia del láser al 15% Active los detectores PMT para líneas verdes y rojas, y establezca la sensibilidad PMT de línea verde y roja a 65. Ajuste el campo de visión a 400 por 400 micrómetros, la resolución de la imagen a 512 por 512 píxeles y la frecuencia de escaneo a 800 hercios. Seleccione el modo de creación de imágenes de lapso de tiempo 3D, luego cree una carpeta y active Guardar automáticamente para guardar datos después de cada adquisición.
Ensamble la cámara de calentamiento y configúrela a 28 grados centígrados. Espere al menos 10 minutos para que la cámara y el objetivo se calienten. Bajo un estereomicroscopio de fluorescencia, identifique embriones al 70% epiboly que expresen GFP.
El, utilizando una pipeta Pasteur de plástico, transfiere de tres a cuatro embriones seleccionados en el plato recubierto de agarosa y los descorona cuidadosamente con fórceps finos. En un pequeño vial de vidrio, agregue un mililitro de una solución de medio embrionario de penicilina-estreptomicina que contenga 2% de agarosa y coloque el vial en un calentador de bloque seco precalentado a 42 grados centígrados. Usando una pipeta de vidrio pulido al fuego, transfiera un embrión decorotado al vial, teniendo cuidado de no agregar demasiado medio embrionario a la agarosa.
Deseche el medio embrionario restante de la pipeta. Aspire el embrión de nuevo, junto con suficiente agarosa para cubrir el portaobjetos del plato con fondo de vidrio. Sople la agarosa con el embrión en el portaobjetos de vidrio del plato, asegurándose de que el embrión no toque el aire o el lado plástico del plato.
Luego, llene la cámara alrededor del portaobjetos de vidrio con agarosa. Usando una pestaña, oriente el embrión para que la región objetivo esté en la parte superior. Después de cinco minutos, cuando la agarosa esté completamente cuajada, agregue unas gotas de medio embrionario de penicilina-estreptomicina al portaobjetos de vidrio.
Coloque el plato con fondo de vidrio debajo del objetivo en la cámara calentada. Sumergir el objetivo en el medio embrionario de penicilina-estreptomicina antes de cerrar la cámara. Mueva el control deslizante para establecer la trayectoria de la luz hacia los oculares.
Encienda la lámpara de fluorescencia. Encuentra un embrión y fija el foco en su superficie. Apague la lámpara de fluorescencia y ajuste la trayectoria de la luz a pmt antes de cerrar la cámara negra.
Comience a tomar imágenes en vivo y localice el mesodermo axial. Para tener una buena señal, ajuste las potencias del láser. Use el canal rojo para mover el escenario hasta la parte superior del embrión y asigne esta posición como Z es igual a cero.
Elija un paso de tiempo de un minuto y un paso Z de dos micrómetros. Coloque la primera rebanada a 15 micrómetros por encima del mesodermo axial, y la última rebanada a 15 micrómetros por debajo del mesodermo axial. Graba de 10 a 15 minutos de una película previa a la ablación.
En las imágenes en vivo, ubique el contorno del polster, luego, utilizando la región de interés del modulador electroóptico, o la herramienta EOM-ROI, dibuje un rectángulo de 20 píxeles de tamaño que abarque el ancho del polster y coloque el rectángulo en el medio del polster. Observe la posición axial de los planos más altos y más bajos a ablacionar, asegurando que el ROI a no se superponga a la celda de yema en ninguno de los planos. Coloque el escenario en la posición Z más baja que se va a ablacionar.
Establezca la primera longitud de onda del láser en 820 nanómetros e ingrese el porcentaje de potencia calculado anteriormente para obtener una potencia de salida de 300 milivatios. Establezca la frecuencia de imagen en 200 hercios y la primera OMA de imagen láser en cero. Después de seleccionar el modo ROI Treat, apague la MOE y configure el tratamiento para que comience inmediatamente después de la trama cero.
Ponga el modo de imagen en Timelapse y desactive el guardado automático. Después de seleccionar el modo rápido en el paso Tiempo, ajuste el número de fotogramas de tratamiento y el número de fotogramas al valor correspondiente a la profundidad objetivo. Comience a crear imágenes.
La adquisición debe ser negra, ya que el obturador de PMT se cierra durante el tratamiento de la MOE. A continuación, suba el escenario a la siguiente posición Z y, de manera similar, realice la ablación. Repita en cada posición Z hasta que se alcance la parte superior del polster.
Cuando se complete el proceso de ablación, configure el primer láser a 920 nanómetros y ajústese a la potencia de imagen elegida previamente. Ponga la primera MOE de imagen láser a 100 y opte por el modo de campo completo. La frecuencia de las imágenes debe ser de 800 hercios, y la MOE debe apagarse antes de examinar toda la pila en modo en vivo para verificar si cada plano ha sido ablacionado.
Una vez que se haya confirmado la ablación, seleccione Lapso de tiempo 3D como modo de imagen. Reactive el guardado automático y comience a grabar la película posterior a la ablación durante 40 a 60 minutos. En la película posterior a la ablación, verifique si las células objetivo fueron ablacionadas de manera efectiva.
Como las ablaciones a través de los polsters no deben dañar a los embriones, la morfología normal de los embriones ablacionados se puede observar hasta 24 horas después de la fertilización. En el resultado exitoso de las ablaciones con láser, los tejidos superpuestos no se vieron afectados por la ablación de las estructuras subyacentes. Un tratamiento demasiado intenso, o muy poco tratamiento, resultó en fallas en la ablación con láser.
Un ejemplo de ablación fallida muestra células por encima del polster siendo ablacionadas, lo que fue evidente por los desechos autofluorescentes en el plano focal por encima del polster. En otro intento ineficaz, las células fueron blanqueadas pero no ablacionadas, y las señales de baja fluorescencia aún revelan los contornos celulares intactos. Finalmente, algunas células ni siquiera se blanquearon debido a un tratamiento con láser insuficiente.
La formación de burbujas se debe a la cavitación inducida por un tratamiento con láser demasiado intenso. Las pilas Z se capturaron cada minuto durante 40 minutos en una ablación exitosa, registrando tanto la GFP citoplasmática como las señales nucleares de mCherry. Además, los núcleos pertenecientes a la mitad anterior del polster están marcados con un punto magenta y rastreados a lo largo del tiempo, antes y después de la ablación.
Como medida de la persistencia de la migración, se estudió la autocorrelación de la dirección de las células antes y después de la ablación. Las células pertenecientes a la parte anterior del polster mostraron un movimiento persistente antes de la ablación, que disminuye drásticamente después de la ablación, lo que indica una pérdida de la migración orientada colectivamente. Alinear correctamente los láseres y medir la potencia del láser son fundamentales para obtener resultados reproducibles.
También es clave comprobar la eficiencia de la ablación en las primeras imágenes posteriores a la ablación. Utilizamos ablaciones con láser para cuestionar el papel de las interacciones célula-célula en la guía de la migración de células dentro del embrión. Pero el procedimiento podría adaptarse fácilmente a muchas otras preguntas donde las células o tejidos necesitan ser ablacionados con precisión, potencialmente profundos en el organismo.
