배아 내에서 세포는 서로 상호 작용하여 화학 및 기계적 정보를 교환합니다. 이러한 상호 작용을 조사하는 한 가지 효율적인 방법은 일부 세포를 죽이고 이웃 세포에 대한 결과를 모니터링하는 것입니다. 우리가 설명하는 방법은 우리가 정확하게 이웃 조직을 손상시키지 않고, 태아 내에서 세포를 ablate 수 있습니다.
제1 레이저를 절제 파장 820 나노미터로 설정하고, 제2 레이저를 mCherry 이미징 파장 1, 160 나노미터에 설정하여 2광광 현미경을 준비한다. 광학 경로에 이동식 거울을 사용하여 스캔 헤드 의 두 레이저 빔을 입력 및 출구로 정렬한 다음 820 나노미터에서 첫 번째 레이저의 최대 출력을 측정합니다. 파워 미터를 목표 아래에 놓고 검은 챔버를 닫고 첫 번째 레이저 전력을 파워 미터에서 데이터 수집을 100 % 시작하고 레이저 셔터를 열고 출력 전력을 측정하고 300 밀리와트에 도달하는 데 필요한 레이저 전력의 비율을 계산합니다.
첫 번째 레이저를 920 나노미터의 GFP 여기 파장에 설정하고 전력을 7%로 조정하여 두 번째 레이저 전력을 15%로 조정하여 녹색 및 빨간색 선에 대한 PMT 검출기를 활성화하고 녹색 및 빨간색 선 PMT 감도를 65로 설정합니다. 시야를 400x400 마이크로미터로 조정하고, 이미지 해상도를 512x 512픽셀로 조정하고, 스캔 주파수를 800 헤르츠로 조정합니다. 3D 시간 경과 이미징 모드를 선택한 다음 폴더를 만들고 Autosave를 활성화하여 각 수집 후 데이터를 저장합니다.
가열 챔버를 조립하고 섭씨 28도로 설정합니다. 챔버와 목표가 따뜻해지려면 적어도 10 분 동안 기다립니다. 형광 스테레오 현미경의 밑에, GFP를 표현하는 70%epiboly에 태아를 확인합니다.
플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 아가로즈 코팅 접시에 3~4개의 선택된 배아를 옮기고 조심스럽게 미세한 집게로 장식합니다. 작은 유리 바이알에서는 2%아가로즈를 함유한 페니실린 연쇄상 구균 배지용액1밀리리터를 넣고, 유리병을 예열된 드라이 블록 히터에 섭씨 42도에 넣습니다. 불을 연마한 유리 파이펫을 사용하여, 아가로즈에 너무 많은 배아 배지를 추가하지 않도록 주의하여, 성모에 성모배전을 전달한다.
파이펫에서 나머지 배아 매체를 폐기합니다. 배아를 다시 흡인하고, 유리 바닥 접시의 슬라이드를 덮을 충분한 아가로즈를 흡입합니다. 접시의 유리 슬라이드에 배아와 아가로즈를 날려 배아가 접시의 공기 또는 플라스틱 측면을 만지지 않도록하십시오.
그런 다음 유리 슬라이드 주위에 챔버를 아가로즈로 채웁니다. 속눈썹을 사용하여, 표적 부위가 상단에 있도록 배아의 방향을 지정합니다. 5 분 후, 아가로즈가 완전히 설정되면, 유리 슬라이드에 페니실린 연쇄 상혈구 배아 배지의 몇 방울을 추가합니다.
유리 바닥 접시를 가열 된 챔버에 목표 아래에 놓습니다. 챔버를 닫기 전에 페니실린 연쇄 절제술 배지에 목표를 담급하십시오. 슬라이더를 이동하여 가벼운 경로를 안구로 설정합니다.
형광 램프를 켭니다. 배아를 찾아 표면에 초점을 설정합니다. 형광 램프를 끄고 검은 색 챔버를 닫기 전에 PMT로 가벼운 경로를 설정합니다.
라이브 이미징을 시작하고 축 중구를 찾습니다. 좋은 신호를 가지고, 레이저 능력을 조정합니다. 빨간색 채널을 사용하여 스테이지를 배아의 맨 위로 이동하고 Z가 0과 같을 때 이 위치를 할당합니다.
1분의 시간 단계와 2마이크로미터의 Z 단계를 선택합니다. 축 중소 더미 위의 15 마이크로미터에서 첫 번째 슬라이스를 설정하고 마지막 슬라이스는 축 중구 보다 15 마이크로미터 아래에 있습니다. 사전 절제 영화의 10~15분을 기록합니다.
라이브 이미징에서 폴스터 윤곽을 찾은 다음, 전자 광학 변조기 영역 또는 EOM-ROI 도구를 사용하여 폴스터의 너비에 걸쳐 있는 20픽셀 대형 사각형을 그리고 폴스터 의 중간에 사각형을 놓습니다. 가장 높고 가장 낮은 평면의 축 위치를 확인하여 ROI가 비행기의 노른자 셀과 겹치지 않도록 합니다. 스테이지를 가장 낮은 Z 위치에 놓습니다.
첫 번째 레이저 파장을 820 나노미터로 설정하고 300 밀리와트의 출구 전력을 얻기 위해 이전에 계산된 전력 백분율을 입력합니다. 이미징 주파수를 200 헤르츠로 설정하고 첫 번째 레이저 이미징 EOM을 0으로 설정합니다. ROI 치료 모드를 선택한 후 EOM을 끄고 0 프레임 직후부터 치료를 시작합니다.
이미징 모드를 타임랩스에 넣고 자동 저장을 비활성화합니다. 시간 단계에서 빠른 모드를 선택한 후 처리 프레임 수와 프레임 수를 대상 깊이에 해당하는 값으로 조정합니다. 이미징을 시작합니다.
EOM 처리 중에 PMT에 대한 셔터가 닫히므로 획득은 검은색이어야 합니다. 다음으로 스테이지를 다음 Z 위치로 이동하여 절제작업을 수행합니다. 폴스터의 상단에 도달 할 때까지 모든 Z 위치에 반복합니다.
절제 과정이 완료되면 첫 번째 레이저를 920 나노미터로 설정하고 이전에 선택한 이미징 전력에 적응합니다. 첫 번째 레이저 이미징 EOM을 100으로 넣고 전체 필드 모드를 선택합니다. 이미징 주파수는 800 헤르츠여야 하며, 모든 비행기가 절단되었는지 확인하기 위해 라이브 모드에서 전체 스택을 검사하기 전에 EOM을 꺼야 합니다.
절제가 확인되면 3D 시간 경과를 이미징 모드로 선택합니다. 자동 저장을 다시 활성화하고 40~60분 동안 포스트 절제 동영상 녹화를 시작합니다. 절제 후 영화에서, 표적 세포가 효과적으로 절단되었는지 확인하십시오.
polsters를 가로지르는 절제는 배아에 해를 끼치지 않아야하므로, ablated 태아의 정상적인 형태는 수정 후 24 시간에서 관찰 될 수 있습니다. 레이저 절제의 성공적인 결과에서, 과다 구조직은 근본적인 구조물의 절제에 의해 영향을 받지 않았습니다. 너무 강렬한 치료, 또는 너무 작은 치료, 레이저 절제에 실패 결과.
실패한 절제의 예는 폴스터 위의 초점 평면에 있는 자동 형광 파편에 의해 명백했던 폴스터 위의 세포를 보여줍니다. 또 다른 비효율적인 시도에서, 세포는 표백되었지만 abed되지 않았고, 낮은 형광 신호는 아직도 그대로 있는 세포 윤곽을 드러냅니다. 마지막으로, 일부 세포는 레이저 치료가 부족하여 표백되지도 않았습니다.
거품의 형성은 너무 강렬한 레이저 치료에 의해 유도 된 캐비테이션에 기인한다. Z-스택은 성공적인 절제에서 40 분 동안 매 분마다 캡처되어 세포질 GFP와 핵 mCherry 신호를 모두 기록했습니다. 또한, 폴스터의 전방 절반에 속하는 핵은 마젠타 점으로 표시되고 시간이 지남에 따라 절제 전후로 추적된다.
마이그레이션 지속성의 척도로서 절제 전후셀의 방향 자동 상관관계가 연구되었습니다. 폴스터의 전방 부분에 속하는 세포는 절제 전에 지속적인 움직임을 표시, 이는 크게 집단 지향 마이그레이션의 손실을 나타내는 절제 후 감소. 레이저를 적절히 정렬하고 레이저 전력을 측정하는 것은 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다.
또한 첫 번째 절제 후 이미지에서 절제 효율을 확인하는 것도 중요합니다. 우리는 레이저 절제를 사용하여 배아 내 세포의 이동을 안내하는 세포 세포 상호 작용의 역할에 의문을 제기합니다. 그러나 절차는 세포 또는 조직이 유기체에 있는 잠재적으로 깊은 정확하게 abLATED될 필요가 있는 많은 그밖 질문에 쉽게 적응될 수 있었습니다.
