تعتبر المنطقة ذات أهمية في ثقافات 3D للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات بسبب تحسين تعدد القدرات وإمكانات التمايز التي شكلتها هذه الثقافة. لقد وصفنا استراتيجية التغليف الخاصة بنا والتي تؤدي إلى تكوين كروي للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. وبمجرد تغليفها، تكون هذه الخلايا الكروية من الخلايا الجذعية قابلة للزراعة، إما في صفائح متعددة الآبار أو مفاعلات حيوية متحركة.
استراتيجية التغليف لدينا هي تحسين البقاء على قيد الحياة من الوباء والكفاءة العالية لتشكيل كروية. يتم حماية الكرويات المغلفة ضد القص أو الطاقة الميكانيكية المرتبطة بالتحريك أو الهزاز. يعتمد تطوير الخلايا الجذعية المشتقة من العلاج الخلوي جزئيا على القدرة على توليد المنتج الخلوي المطلوب بطريقة قابلة للتطوير وفعالة وفعالة من حيث التكلفة.
تمثل تقنية التغليف الموضحة هنا خطوة في هذا الاتجاه. من المحتمل أن تكون تقنية التغليف الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على زراعة 3D لأنواع الخلايا المختلفة من الخلايا الأخرى إلى الخلايا الجذعية الأخرى متعددة القدرات. ابدأ بتحضير 30 ملليلتر من محلول المخزون الأساسي مرتين عن طريق خلط 4.8 جرام من 35 كيلودالتون بيج ، و 10.2 ملليلتر من وسائط تدرج الكثافة ، و 19.8 ملليلتر من وسائط DMEM / F-12.
ثم قم بتصفية هذا الحل الأساسي باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بإعداد 50 ملليلتر من الزيت المعدني مع 3 في المائة من الفاعل بالسطح عن طريق خلط 48.5 ملليلتر من الزيت المعدني و 1.5 ملليلتر من الفاعل بالسطح. ثم قم بتعقيم المحلول عن طريق تمريره عبر مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
بعد ذلك ، قم بإعداد 1 مول DTT ، و 1 مول TEA ، و 1 في المائة من حلول PF127 ، كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم قم بإعداد مستحلب متقاطع عن طريق خلط 4.5 ملليلتر من الزيوت المعدنية مع 3 في المائة من الفاعل بالسطح و 300 ميكرولتر من 1 DTT مولار. بعد دوامة المحلول لمدة دقيقتين ، سونيكات لمدة 45 إلى 60 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية عند 20 درجة مئوية وتحميله إلى حقنة 5 ملليلتر بإبرة قياس 27.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول زيت التدريع عن طريق تحميل الزيت المعدني بنسبة 0.5 في المائة من الفاعل بالسطح في حقنة سعة 5 ملليلتر بإبرة قياس 27. لتحضير محلول القشرة ، أضف 32 ملليغرام من ماليميد PEG4 في 400 ميكرولتر من DPBS. ثم ، أضف 6 ميكرولترات من 1 شاي مولار.
دوامة الحل لمدة 2 دقيقة والطرد المركزي من خلال مرشح الدوران. احتفظ بالمحلول في الظلام على الروك لمدة 30 دقيقة قبل تحميله في حقنة 1 ملليلتر بإبرة قياس 27. وأخيرا، قم بإعداد الحل الأساسي النهائي عن طريق إعادة تعليق 20 مليون hPSCs في وسائط 200 ميكرولتر ومزجها مع 30 ميكرولتر من 1 في المائة PF127 و 200 ميكرولتر من الحل الأساسي 2X.
أدخل قضيب تحريك صغير في حقنة 1 ملليلتر. ثم قم بتحميل الخلية التي تحتوي على محلول أساسي في المحقنة بإبرة قياس 27. ابدأ بوضع جهاز قطرات PDMS المستعبدة ، و 4 قطع بطول 20 سم ، وقطعة واحدة من الأنابيب الدقيقة ذات المدخل بطول 5 سم ، وقطعة واحدة من أنبوب مخرج 10 سم و 6 قطع من أنابيب تركيب 0.5 سم تحت مصدر الضوء المبيد للجراثيم لمدة 30 دقيقة للتعقيم.
الآن قم بتركيب 4 قطع من الأنابيب الدقيقة ذات المدخل الطويل 20 سم في القشرة والزيت ومستحلب الوصلة المتقاطعة ومداخل جهاز التفكك باستخدام الملقط. ثم ، أدخل الطرف الآخر من الأنابيب في إبرة المحقنة مع المحلول المقابل. وفي الوقت نفسه ، قم بتوصيل المدخل الأساسي لأجهزة الموائع الدقيقة ومخرج أجهزة التفكك بأنبوب دقيق 5 سم.
أدخل 1 أنبوب مخرج في منفذ مخرج السوائل وضع الطرف الآخر في خزان التجميع. بعد ذلك ، ضع الجهاز على مرحلة المجهر وقم بإرفاق الأنابيب لتجنب أي حركة. قم بمحاذاة المجهر وتركيزه على فوهة الجهاز لفحص التدفق.
ضع كل حقنة على مضخات حقنة مختلفة وقم بتأمينها بشكل صحيح. قم ببرمجة كل مضخة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة لمعدلات التدفق المذكورة في مخطوطة النص ، وابدأ التدفق في جميع المضخات. انتظر حتى يدخل كل سائل إلى الجهاز واملأ القنوات أثناء دفع الهواء المتبقي للخارج.
عندما يتم تثبيت تكوين الكبسولة ، ضع الطرف الآخر من أنبوب التجميع في أنبوب مخروطي جديد يحتوي على 5 ملليلتر من وسائط mTeSR. بمجرد جمع كبسولات كافية ، احتضنها لمدة 10 دقائق. ستكون الكبسولات الموجودة في مرحلة الزيت في الجزء العلوي من الأنبوب ، والتي تنتقل الرواسب إلى الأسفل عند النقر بلطف على الأنبوب.
لاسترداد الكبسولات ، ابدأ بإزالة الزيت من أنبوب التجميع. ثم ضع الكبسولات على مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر بحجم المسام واغسل المصفاة بكميات وفيرة من الوسائط. عكس المرشح فوق بئر من لوحة ثقافة 6 آبار وجمع الكبسولات الدقيقة عن طريق تمرير 2 ملليلتر من الوسائط عبر الفلتر.
احتضان كبسولات الخلايا الجذعية في طبق من 6 آبار عند 37 درجة مئوية مع 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسائط كل يومين عن طريق جمع الكبسولات على مرشح مصفاة الخلايا ، وغسلها بالوسائط الزائدة وإعادة تعليقها إلى بئر جديد في ألواح 6 آبار مع وسائط 2 ملليلتر. قم بإجراء فحص الجدوى عن طريق إضافة 4 ميكرولترات من 2 ميكرومولار إيثيديوم هوموديمر-1 وميكرولتر من 4 ميكرومولار كالسين-AM المحاليل إلى 2 ملليلتر من DPBS المعقمة.
دوامة لضمان الخلط الكامل. جمع ما يقرب من 100 كبسولة صغيرة على مصفاة الخلايا وشطفها مع DPBS معقمة للسماح بانتشار متوسط من الكبسولات. اجمعها مرة أخرى في صفيحة استزراع مكونة من 12 بئرا باستخدام 1 ملليلتر من المحلول المحضر الذي يحتوي على Ethidium Homodimer-1 و calcein AM واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
تصور الخلايا تحت المجهر الفلوري. أظهرت الكبسولات الدقيقة المثلى ودون المثلى المصنعة باستخدام توليد قطرات الموائع الدقيقة اختلافات في مورفولوجيا الكبسولة كدالة لمحتوى PEG4-Maleimide في القشرة. ترتبط الكبسولات الملساء ذات الحواف الساطعة بالسلامة الميكانيكية المطلوبة.
يشير تجميع الخرز في وسط الكبسولات إلى أن النواة كانت مائية وأن الخرز كان حرا في الحركة. أشارت الحلقة الفلورية إلى وجود قشرة هيدروجيل وتم استخدامها لتحديد سمك القشرة. أظهرت البقع الحية أو الميتة بعد 6 ساعات من تغليف خلايا H9 أن الخلايا حققت أكثر من 95 في المائة من الجدوى بشكل روتيني أثناء عمليات التغليف.
عند مقارنة معدل النمو وإمكانات التمايز للكرويات المغلفة مقابل الكروية غير المغلفة. وتقرر أن عملية التغليف ليس لها أي آثار ضارة على مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. يرجى تذكر أنه من المهم تحديد نسبة معدل التدفق المثلى بين الغلاف الأساسي وتيارات النفط.
قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى كبسولات لن تكون قوية ميكانيكيا وقد تتمزق أثناء المناولة. نود أن نشير إلى أن تقنية التغليف هذه كانت لأنواع الخلايا الأخرى غير الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. لقد قمنا بتغليف خطوط الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية الوسيطة باستخدام استراتيجية مماثلة.
حاليا، يقوم فريقنا بتطوير الجيل القادم من اللقطات الدقيقة. هذه اللقطات الدقيقة نشطة بيولوجيا ويمكن تحميلها بعوامل متقاطعة للتمايز المغلف للخلايا الجذعية.
