يساعد بروتوكولنا على تصوير الأوكسجين للكرويات متعددة الخلايا باستخدام المجهر الفلوري التقليدي. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء إنتاج الآلاف من الأنسجة الدقيقة الكروية الملطخة بمسبار الأكسجين واستخدامها لاحقا في تطبيقات الطباعة ثلاثية الأبعاد. على سبيل المثال ، ترقيع الأنسجة العظمية الوعائية.
مسبار الأكسجين القريب من الأشعة تحت الحمراء متوافق مع استخدام أصباغ أخرى مثل تلطيخ التألق الأخضر في نهاية المطاف ، وهذا يسمح بالتحليل الحي ومتعدد المعلمات على المدى الطويل. انقل طوابع PDMS ذات النقوش الدقيقة من قارورة تخزين إلى طبق بتري معقم وجفف الهواء مع السطح الأملس تحت ظروف تدفق الهواء الرقائقي المعقم لمدة 10 دقائق. ضع كل ختم في منتصف بئر لوحة زراعة الأنسجة المعقمة المكونة من 12 بئرا.
يجف في الهواء لمدة دقيقة إلى دقيقتين بغطاء مفتوح. تحضير 50 ملليلتر من محلول الأغاروز المتجانس بنسبة 3٪ وإضافة ما يقرب من ملليلتر من محلول الأغاروز الساخن على الفور إلى كل بئر من لوحات ال 12 بئر لتغطية ختم PDMS المدرج. تصلب الأغاروز لمدة 20 دقيقة عن طريق احتضانه تحت تدفق الهواء المعقم.
باستخدام ملعقة معقمة ، اقلب الأغاروز مع ختم PDMS المضمن رأسا على عقب في كل بئر. أضف ما يقرب من 200 ميكرولتر من الماء المعقم على الجانب العلوي الناعم من الختم. افصله عن الأغاروز باستخدام ملعقة وأخرجه من البئر.
أضف ملليلتر واحد من وسائط زراعة الخلايا المعقمة المقابلة إلى طوابع الأغاروز للاستخدام المباشر. غطي الطبق بالغطاء واحتضنيه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قبل الاستخدام ، قم بتسخين الألواح ذات النقوش الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
شطف 70٪ إلى 90٪ من زراعة خلايا الالتقاء مع PBS قبل التسخين. أضف محلول الإنزيم المنفصل واحتضنه لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. في وقت لاحق ، قم بتحييد التربسين باستخدام وسائط زراعة الخلايا الكاملة التي تحتوي على 10٪ FBS.
للحصول على تعليق خلية واحدة ، قم بفصل مجاميع الخلايا باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر في الجزء العلوي من الماصة المصلية. باستخدام غرفة العد ، قم بحساب عدد الخلايا لكل ملليلتر من تعليق الخلية. قم بتخفيف تعليق الخلية إلى 500،000 خلية لكل ملليلتر وأضف محلول مسبار الأكسجين المركز إليه.
قم بإزالة الوسائط القديمة من الآبار ذات النقوش الدقيقة للوحة زراعة الخلايا المغلفة بالأغاروز المكونة من 12 بئرا وأضف ملليلتر واحد من تعليق الخلية المحضر إلى الآبار. استزرع الكرويات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى خمسة أيام في وجود مستمر لمسبار الأكسجين لضمان تحميله أثناء تكوين كروي وضغطه. أغلق نهاية خرطوشة معقمة بثلاثة سنتيمترات مكعبة بغطاء طرف واملأها بالحبر الحيوي عن طريق السحب.
أدخل مكبس في الخرطوشة وأمسكه رأسا على عقب. قم بإزالة غطاء الطرف وادفع المكبس نحو الحبر الحيوي حتى تتم إزالة كل الهواء من الخرطوشة. قم بتبريد الحبر الحيوي في عباءة التسخين الخاصة بالطابعة الحيوية عند 23 درجة مئوية.
رش الطابعة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول وجففها بورق ممتص. المسمار في محول الضغط في الجزء العلوي من خرطوشة. قم بتركيب إبرة بولي إيثيلين مخروطية قياس 22 على الخرطوشة.
قم بتركيب الخرطوشة في عباءة التسخين على رأس الطباعة القائم على البثق. قم بتوصيل مدخل الضغط وافتح المشبك الموجود على المدخل. قم بتحميل ملف G-code الخاص بتصميمك في برنامج الطباعة.
ابدأ قياس طول الإبرة. قم بتنظيم ضغط الطباعة عن طريق توزيع القليل من الحبر الحيوي في طبق بتري معقم. قم بتثبيت لوحة من ستة آبار ، وافتح لوحة البئر ، وأغلق الغطاء واطبع.
بعد الطباعة ، دع السقالات متقاطعة فعليا لمدة 10 دقائق عند خمس درجات مئوية. قم بتشعيع السقالات المطبوعة لمدة 60 ثانية باستخدام مصباح LED فوق البنفسجي. أضف على الفور وسائط النمو المقابلة التي تحتوي على محلول مضاد حيوي مزدوج إلى جميع الآبار ذات الشبكات المطبوعة بيولوجيا.
استزرع السقالات عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. للمراقبة المجهرية ، انقل شبكة وافل مطبوعة إلى غطاء طبق مجهري مع وسائط تصوير. باستخدام ماصة ملليلتر واحدة ، اغسل بلطف مسبار الأكسجين الكروي الملطخ مسبقا من آبار الأغاروز الصغيرة وانقلها إلى أنبوب سفلي مخروطي 15 ملليلتر.
لضمان جمع جميع الكرويات من بئر صغير النقوش ، اشطف البئر مرة إلى ثلاث مرات باستخدام ملليلتر إضافي من وسائط الاستزراع واجمع بين جميع المعلقات الكروية في قارورة واحدة. اترك القارورة عمودية لمدة تصل إلى 10 دقائق للسماح للكرويات بالاستقرار في القاع. قم بإزالة الوسائط بعناية من الأنبوب مع ترك الكرويات دون إزعاج.
أضف وسيطا مستزرعا طازجا يكفي لما لا يقل عن 20 كرويا لكل طبق عينة وأعد تعليق الكرويات بلطف عن طريق السحب. أضف على الفور حجما متساويا من التعليق الكروي إلى كل بئر مجهري مطلي مسبقا. اترك الكرويات لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لتعلق على سطح المجهر جيدا.
قم بإزالة الوسط من الفحص المجهري جيدا وشطفه مرة واحدة باستخدام وسائط التصوير. أضف الكمية الدقيقة من وسائط التصوير إلى العينة. قم بإعداد الفحص المجهري جيدا باستخدام كرويات ملطخة على مرحلة الفحص المجهري.
باستخدام هدف التكبير 10X، قم بمعاينة العينة في ضوء الإرسال. قم بالتركيز الأولي على الكرويات ، وحددها في وسط الصورة وجلب الهدف مع التكبير العالي المطلوب إلى وضع العمل. ركز على وضع ضوء الإرسال في المقطع العرضي الاستوائي للكروية.
اضبط الإعدادات لجمع إشارات التألق أو الفسفور ذات القنوات الطيفية المرجعية والحساسة لمسبار الأكسجين وابدأ عملية التصوير. افتح ملف vsi مع بيانات كثافة مسبار الأكسجين من القنوات الطيفية المرجعية والحساسة في الوضع المدمج. افتح نافذة وظيفة تحليل النسبة من قائمة القياس.
اختر شدة القناة المرجعية كبسط وشدة القناة الحساسة كمقام لحساب R. في نافذة تحليل النسبة، قم بتطبيق إعدادات عتبة الكثافة المقابلة على كل قناة طيفية لطرح الخلفية من صورة الكثافة المدمجة. تحدد أقنعة عائد الاستثمار المطبقة على الصور الكروية الحدود الكروية.
قم بزيادة قيم العتبة حتى تصبح خلفية الصورة سوداء بشكل موحد. في نافذة تحليل النسبة، اضبط عامل القياس على صورة النسبة حتى توفر صورة المعاينة الدقة المطلوبة لتدرج R. تتم إضافة صورة توزيع نسبة الكثافة كطبقة إلى الصورة الأصلية متعددة القنوات.
في نافذة الصورة متعددة القنوات ، قم بتنشيط الطبقة بشريط ألوان زائف. حدد يدويا حدود الربط وإلغاء الربط للرسم البياني لتوزيع النسبة باستخدام خيار القياس الثابت في نافذة ضبط العرض. افتح صورة ضوء الإرسال المقابلة للكرويات.
اختر دالة المسطرة الخطية وقم بقياس قطر الكرويات. تصدير البيانات كملف جدول بيانات. اختر عائد الاستثمار للحجم والشكل المطلوبين وقم بتطبيقه على المحيط وقلب نقص الأكسجين في الكروية.
قم بتحويل عائد الاستثمار إلى كائن القياس لتحليل متوسط R داخل عائد الاستثمار المختار. تصدير البيانات بتنسيق جدول متوافق مع جدول بيانات. تطبيق القياسات على كل قسم من أقسام الفحص المجهري للكرويات للحصول على مجموعة بيانات الأقطار الكروية RC و RP لإجراء المزيد من الحسابات والمقارنة الإحصائية.
دمج جميع البيانات في ملف جدول بيانات واحد. يتميز مسبار MMIR1 بتبييض ضوئي منخفض وهو مناسب للدراسة في الوقت الفعلي للاستجابة التنفسية السريعة في كرويات hDPSC لمحفزات الميتوكوندريا المختلفة. أظهر FCCP فقط تأثير فك ارتباط خفيف في بعض المناطق ثم انخفض قليلا من تنفس الخلايا.
من ناحية أخرى ، ثبط الروتينون بقوة التنفس مما أدى إلى إعادة الأكسجين الكروي وتبديد تدرجات الأكسجين من المحيط إلى القلب في غضون 80 ثانية تقريبا بعد التحفيز. باستخدام البروتوكول الآلي لحسابات نسبة كثافة البكسل حسب البكسل التي يوفرها برنامج التصوير ، يتم تصور تدرجات الأكسجين المحيطية إلى الأساسية المكتشفة في الوقت الفعلي في جميع الأنواع الكروية مع المحيط المؤكسج ومنافذ نقص الأكسجين في المركز. تصور الرسوم البيانية هنا ملامح نسبة المقاطع العرضية الكروية الاستوائية لأنواع كروية مختلفة.
بالمقارنة مع الكرويات hDPSC متجانسة الخلايا ، كان لدى hDPSC إلى كرويات HUVEC متجانسة تدرجات أكثر حدة بشكل ملحوظ. من المحتمل أن يتم إنشاء تدرج الأكسجين من المحيط إلى القلب في الكرويات غير المتجانسة بواسطة hDPSC في تكوينها وفقا لأوكسجين hDPSC الكروي الذي له نشاط تنفس قوي. تظهر الرسوم البيانية أن كرويات hDPSC المطبوعة بيولوجيا لها محيط مؤكسج بشكل كبير من الكرويات التي تم قياسها قبل الطباعة الحيوية بينما كان للأكسجين الأساسي قيم مماثلة.
إذا كان هطول الأمطار العرضي للمسبار يزعج تكوين كروي موحد ، فقم بتصفية أو طرد مركزي لمحلول المسبار بسرعة عالية قبل الاستخدام. يعد تصحيح قياس طول الإبرة وتنظيم الضغط من الخطوات الأساسية لمطابقة معدل الطباعة الحيوية وقطر الدعامة والمجاميع الدقيقة للطباعة الحيوية في سقالة مسامية. اختر إعدادات الفحص المجهري لتصوير المسبار الحساس للأكسجين ، مع مراعاة تأثيرها على الاستقرار الضوئي للمسبار.
التصوير بالأكسجين متوافق مع العديد من أنواع قياسات الفحص المجهري الحي. بعد التصوير ، يمكن للمرء أيضا إجراء التألق المناعي ، أو استخراج البروتينات للنشاف الغربي ، أو إجراء تحليل التعبير الجيني.
