Alan, bu kültürün oluşturduğu gelişmiş pluripotens ve farklılaşma potansiyeli nedeniyle insan pluripotent kök hücrelerinin 3D kültürlerine ilgi duyduğu düşünülmektedir. İnsan pluripotent kök hücre sferoidlerinin tekrarlanabilir oluşumuna yol açan kapsülleme stratejimizi tanımladık. Kapsüllendikten sonra, bu kök hücre sferoidleri, çok kuyulu plakalarda veya karıştırılmış biyoreaktörlerde ekime uygundur.
Kapsülleme stratejimiz, pestilansın hayatta kalma kabiliyetini ve küresel oluşumun yüksek verimliliğini optimize etmektir. Kapsüllenmiş sferoidler, karıştırma veya sallanma ile ilişkili kesme veya mekanik enerjiye karşı korunur. Hücresel tedaviden türetilen kök hücrelerin geliştirilmesi, kısmen istenen hücresel ürünü ölçeklenebilir, verimli ve uygun maliyetli bir şekilde üretme yeteneğine bağlıdır.
Burada açıklanan kapsülleme teknolojisi bu yönde atılmış bir adımı temsil etmektedir. Burada açıklanan kapsülleme teknolojisi muhtemelen diğer hücrelerden diğer pluripotent kök hücrelere kadar çeşitli hücre tiplerinin 3D yetiştirilmesi için geçerli olacaktır. 4,8 gram 35 kilodalton PEG, 10,2 mililitre yoğunluk gradyanı ortamı ve 19,8 mililitre DMEM/F-12 ortamını karıştırarak 30 mililitre iki kat çekirdek stok çözeltisi hazırlayarak başlayın.
Ardından bu çekirdek çözeltiyi 0,22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Daha sonra, 48.5 mililitre mineral yağ ve 1.5 mililitre yüzey aktif maddeyi karıştırarak yüzde 3 yüzey aktif madde ile 50 mililitre mineral yağ hazırlayın. Daha sonra çözeltiyi 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirerek sterilize edin.
Daha sonra, metin makalesinde açıklandığı gibi 1 molar DTT, 1 molar TEA ve yüzde 1 PF127 çözeltileri hazırlayın. Daha sonra 4.5 mililitre mineral yağı yüzde 3 yüzey aktif madde ve 300 mikrolitre 1 molar DTT ile karıştırarak bir çapraz bağlayıcı emülsiyonu hazırlayın. Çözeltiyi iki dakika boyunca vorteksledikten sonra, 20 santigrat derecede ultrasonik bir banyoda 45 ila 60 dakika boyunca sonikasyon yapın ve 27 gauge iğne ile 5 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin.
Daha sonra, mineral yağı yüzde 0,5 yüzey aktif madde ile 27 gauge iğneli 5 mililitrelik bir şırıngaya yükleyerek koruyucu yağ çözeltisi hazırlayın. Kabuk çözeltisini hazırlamak için, 400 mikrolitre DPBS'ye 32 miligram PEG4 maleimid ekleyin. Ardından, 6 mikrolitre 1 molar TEA ekleyin.
Çözeltiyi 2 dakika boyunca vorteksleyin ve bir sıkma filtresinden santrifüj yapın. 27 gauge iğne ile 1 mililitrelik bir şırıngaya yüklemeden önce çözeltiyi rocker üzerinde 30 dakika karanlıkta tutun. Son olarak, 200 mikrolitrelik ortamda 20 milyon hPSC'yi yeniden askıya alarak nihai çekirdek çözümünü hazırlayın ve 30 mikrolitre yüzde 1 PF127 ve 200 mikrolitre 2X çekirdek çözeltisi ile karıştırın.
1 mililitrelik bir şırıngaya küçük bir karıştırıcı çubuğu yerleştirin. Ardından, çekirdek çözeltisi içeren hücreyi 27 gauge iğne ile şırıngaya yükleyin. Bağlı PDMS damlacık cihazını, 4 adet 20 santimetre uzunluğunda ve 1 adet 5 santimetre uzunluğunda giriş mikrotüpünü, 1 adet 10 santimetre çıkış tüpünü ve 6 adet 0,5 santimetre montaj tüpünü mikrop öldürücü ışık kaynağının altına sterilizasyon için 30 dakika boyunca yerleştirerek başlayın.
Şimdi 4 adet 20 santimetre uzunluğundaki giriş mikrotüplerini forseps kullanarak kabuğa, yağa, çapraz bağlayıcı emülsiyonuna ve ayrışma cihazı girişlerine sığdırın. Ardından, tüplerin karşı ucunu karşılık gelen çözelti ile şırınga iğnesine yerleştirin. Bu arada, mikroakışkan cihazların çekirdek girişini ve ayrışma cihazlarının çıkışını 5 santimetrelik bir mikrotüp ile bağlayın.
Akışkan çıkış portuna 1 çıkış tüpü yerleştirin ve karşı ucu bir toplama haznesine yerleştirin. Ardından, cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin ve herhangi bir hareketi önlemek için boruyu takın. Akış denetimi için mikroskobu cihaz nozuluna hizalayın ve odaklayın.
Her şırıngayı farklı şırınga pompalarına yerleştirin ve uygun şekilde sabitleyin. Her pompayı üreticinin protokollerine göre metin yazısında belirtilen akış hızlarına göre programlayın ve tüm pompalarda akışı başlatın. Her sıvının cihaza girmesini bekleyin ve kalan havayı dışarı iterken kanalları doldurun.
Kapsül oluşumu stabilize edildiğinde, toplama tüpünün karşı ucunu 5 mililitre mTeSR ortamı içeren yeni bir konik tüpe yerleştirin. Yeterli kapsül toplandıktan sonra, 10 dakika boyunca inkübe edin. Yağ fazında bulunan kapsüller, tüpün tepesinde olacak ve tüpe hafifçe dokunulduğunda dibe çökelecektir.
Kapsülleri almak için, toplama tüpünden yağı çıkararak başlayın. Ardından, kapsülleri 100 mikrometre gözenek boyutunda bir hücre süzgeci üzerine yerleştirin ve süzgeci bol miktarda ortamla yıkayın. Filtreyi 6 delikli bir kültür plakasının bir kuyucuğunun üstüne ters çevirin ve filtreden 2 mililitre ortam geçirerek mikrokapsülleri toplayın.
Kök hücre kapsüllerini, yüzde 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 6 kuyucuklu bir kültür kabında inkübe edin. Kapsülleri bir hücre süzgeci filtresinde toplayarak, fazla medya ile yıkayarak ve 2 mililitrelik ortama sahip 6 delikli plakalarda yeni bir kuyuya yeniden askıya alarak medyayı her gün değiştirin. 2 mililitre steril DPBS'ye 2 mikromolar Ethidium Homodimer-1'in 4 mikrolitresini ve 4 mikromolar Calcein-AM çözeltisinin 1 mikrolitresini ekleyerek canlılık testi yapın.
Tam karıştırma sağlamak için vorteks. Bir hücre süzgeci üzerinde yaklaşık 100 mikrokapsül toplayın ve kapsüllerden orta difüzyona izin vermek için steril DPBS ile durulayın. Ethidium Homodimer-1 ve kalsein içeren hazırlanmış çözeltinin 1 mililitresini kullanarak 12 kuyucuklu bir kültür plakasında tekrar toplayın ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Hücreleri floresan mikroskobu altında görselleştirin. Mikroakışkan damlacık üretimi kullanılarak üretilen optimal ve yetersiz mikrokapsüller, kabuktaki PEG4-Maleimide içeriğinin bir fonksiyonu olarak kapsül morfolojisinde farklılıklar göstermiştir. Parlak kenarlı pürüzsüz kapsüller, istenen mekanik bütünlük ile ilişkilidir.
Boncukların kapsüllerin merkezinde toplanması, çekirdeğin sulu olduğunu ve boncukların hareket etmekte serbest olduğunu gösterir. Floresan anulus, bir hidrojel kabuğun varlığını gösterdi ve kabuk kalınlığını belirlemek için kullanıldı. H9 hücrelerinin kapsüllenmesinden 6 saat sonra canlı veya ölü boyamalar, hücrelerin kapsülleme çalışmaları sırasında rutin olarak yüzde 95'ten fazla canlılık elde ettiğini göstermiştir.
Enkapsüllenmiş ve kapsüllenmemiş sferoidlerin büyüme hızı ve farklılaşma potansiyeli karşılaştırıldığında. Kapsülleme işleminin hPSC'ler üzerinde herhangi bir olumsuz etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Lütfen unutmayın, çekirdek kabuk ve yağ akışları arasında optimum akış hızı oranının belirlenmesi önemlidir.
Bunu yapmamak, mekanik olarak güçlü olmayacak ve kullanım sırasında yırtılabilecek kapsüllere neden olabilir. Bu kapsülleme tekniğinin insan pluripotent kök hücreleri dışındaki hücre tipleri için olduğunu belirtmek isteriz. Benzer bir strateji kullanarak, öncelikle hipotezleştirilmiş, kanser hücre hatlarını ve mezenkimal kök hücreleri kapsülledik.
Şu anda, ekibimiz yeni nesil mikro yakalamaları geliştiriyor. Bu mikro yakalamalar biyoaktiftir ve kök hücrelerin kapsüllenmiş farklılaşması için çapraz faktörlerle yüklenebilir.
