على مر السنين، وقد استخدمت Monolayers الدهون كطبقة داعمة لتعزيز بلورة 2D من بروتينات الغشاء المحيطي، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تبلور 2D، وبعض البروتينات غشاء لا يتجزأ. ولكن يتطلب إجراء تحقيق تجريبي أكثر شمولا لتحديد المنظفات وظروف غسيل الكلى لتعزيز التقسيم إلى طبقة أحادية الدهون.
تتشكل طبقة أحادية الدهون في واجهة ماء الهواء ، بحيث تظل مجموعات الرأس القطبية للدهون رطبة في المرحلة المائية. وذيول أسيل غير القطبية من القسم الدهون إلى واجهة مياه الهواء، الذي يكسر التوتر السطحي وتسطيح سطح الماء. تهمة طبيعة moieties الكيميائية المميزة للمجموعات رئيس الدهون توفير تقارب للبروتينات في الحل.
تعزيز الربط، وفي تكوين الصفيف 2D المبدأ. يمكن نقل أي بلورات ثنائية الأبعاد تتشكل على طبقة أحادية الدهون بسهولة إلى المجهر الإلكتروني على شبكة EM مغلفة بالكربون تستخدم لرفع ودعم الصفيف البلوري على طبقة الدهون. وصفنا في هذه المخطوطة، منهجية أحادية الطبقة للدهون لتصوير المجهر الإلكتروني المبرد.
إعداد أحادي الطبقة الدهون. إعداد مخزون الدهون، وإعداد 0.01 ملغ لكل مل خليط الدهون في حجم 9:1 لحجم الكلوروفورم، الميثانول. باستخدام 8.91 مل من الكلوروفورم و 0.99 مل من الميثانول و 0.1 مل من محلول 10 ملغ لكل مل من الدهون.
إعداد لوحة تفلون. سونيكاتي لوحة تفلون في حمام الميثانول لمدة خمس دقائق. يغسل بالماء الساخن لمدة 15 دقيقة ثم يشطف بالماء المقطر.
جفف صفيحة تفلون في مجفف لمدة 30 دقيقة وأبقها تحت الفراغ حتى الاستخدام. تشكيل أحادي الطبقة الدهون على خزان العازلة. وقت التشغيل المقدر سيكون ساعة ونصف.
ضع ورقة تصفية من نوع واحد في طبق بيتري وقم بترتيب كتلة تفلون أعلى ورقة التصفية. ملء الآبار من لوحة تفلون مع 60 ميكرولتر من العازلة. إضافة بعناية خليط السائل على رأس سطح العازلة قطرة قطرة.
من الناحية المثالية واحد ميكرولتر لكل قطرة باستخدام حقنة هاملتون. بلل ورق الفلتر بالماء المقطر و حافظ على الرطوبة في طبق بيتري. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة، يجب أن يتبخر الكلوروفورم وينبغي تشكيل طبقة أحادية من الدهون على سطح المخازن المؤقتة.
تطبيق شبكة EM على طبقة أحادية الدهون. وقت التشغيل المقدر ساعة ونصف. ضع بلطف شبكة EM المغلفة بالكربون دون توهج تفريغ جانب الكربون لأسفل على سطح كل خزان عازل.
حقن البروتينات بعناية في حقن الجانب جيدا، واستخدام تركيزات البروتين النهائي في البئر حول ميكرومولار واحد. احتضان 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. حقن بلطف ما يقرب من 20 إلى 30 ميكرولتر من العازلة في منفذ الحقن الموقع لرفع الشبكة فوق سطح كتلة تفلون.
هذا يسمح لك لالتقاط الشبكة مع زوج من الملاقط ورفعه عموديا قبالة القطيرات. النتائج التمثيلية. يمكن تصور طبقة أحادية الدهون المودعة على شبكة EM تحت المجهر الإلكتروني الإرسال دون تلطيخ التباين.
يمكن التعرف على وجود أحادي الطبقة ، من خلال الفرق التباين من المنطقة دون أي عينة في مسار الحزمة هذا. المناطق التي لديها تغطية أحادية الطبقة الدهنية لديها تباين أقل من تلك التي لا تغطيها. منذ شعاع الإلكترون من خلال الثقوب الفارغة لا يوجد لديه التشتت فإنه يظهر إضاءة أكثر إشراقا.
في الختام، طريقة أحادية الطبقة الدهنية يوفر فرصة لدراسة هياكل البروتين بسبب بساطته. وقد يوفر نهجا بديلا لتسهيل عملية التبلور 2D.
