使用脂质单层方法进行电子晶体学研究的样品制备

多年来，脂质单层已被用作支撑层，以促进外周膜蛋白以及可溶性蛋白的2D结晶。这种方法也可以应用于2D结晶，作为一些整体膜蛋白。但需要更广泛的实证研究来确定洗涤剂和透析的条件，以促进分配到脂质单层。

脂质单层在空气水界面处形成，使得脂质的极头基团在水相中保持水合。而脂质的非极性酰基尾部则与空气水界面相连，从而打破了表面张力，使水面变平。脂头基团的电荷性质独特的化学部分提供了对溶液中蛋白质的亲和力。

促进结合，原则上形成2D阵列。在脂质单层上形成的任何2D晶体都可以很容易地转移到碳包被的EM网格上的电子显微镜中，该网格用于提升和支撑脂质层上的晶体阵列。我们在这份手稿中描述了一种用于低温电子显微镜成像的脂质单层方法。

脂质单层制剂。制备脂质储备，以9:1体积至体积的氯仿，甲醇制备0.01mg每毫升脂质混合物。使用8.91ml氯仿和0.99ml甲醇和0.1ml每ml脂质溶液10mg。

特氟龙板制备。在甲醇浴中超声处理特氟龙板五分钟。用热水清洗15分钟，然后用蒸馏水冲洗。

将特氟龙板干燥干燥30分钟，并保持在真空下直至使用。缓冲液储集层上脂质单层的形成。预计运行时间为一个半小时。

将一型滤纸放入培养皿中，并将特氟龙块放在滤纸的顶部。用60微升缓冲液填充特氟龙板的孔。小心地将液体混合物逐滴加入在缓冲液表面的顶部。

理想情况下，使用汉密尔顿注射器每滴一微升。用蒸馏水润湿滤纸，并保持培养皿中的湿度。在室温下孵育60分钟，氯仿应蒸发，并在缓冲液表面形成单层脂质。

在脂质单层上应用EM网格。预计运行时间为一个半小时。轻轻地将碳涂层的EM网格放置在每个缓冲储液器的表面上，而不会发光，将碳排放到每个缓冲液槽的表面上。

小心地将蛋白质注射到侧面注射孔中，在一个微摩尔周围的孔中使用最终蛋白质浓度。在室温下孵育60分钟。在位点注射口中轻轻注入约20至30微升缓冲液，以将网格提升到特氟龙块表面以上。

这允许您用一对镊子拾取网格，并将其垂直地从液滴上抬起。具有代表性的结果。沉积在EM网格上的脂质单层可以在透射电子显微镜下可视化，而无需造影剂染色。

单层的存在可以通过与光束路径中没有任何试样的区域的对比度差异来识别。脂质单层覆盖的区域比没有覆盖的区域具有更低的对比度。由于通过空孔的电子束没有散射，因此它显示出更亮的照明。

总之，脂质单层方法由于其简单性而为研究蛋白质结构提供了机会。它可以提供一种替代方法来促进2D结晶的过程。