هذا البروتوكول مهم لأنه سهل التنفيذ وفي متناول أي مختبر. يسمح هذا البروتوكول بعزل الببتيدات HLA أو MHC من النوع الأول أو النوع الثاني من عينات الإنسان أو الماوس. يمكن لهذه الطريقة معالجة الأسئلة العلمية المتعلقة بجميع مجالات البحث التي تنطوي على الجهاز المناعي ، سواء في السرطان أو علم الفيروسات أو أمراض المناعة الذاتية.
تم بناء هذا البروتوكول ليكون في متناول أي شخص يعمل في مختبر البحوث. ما عليك سوى اتباع الخطوات. ابدأ في تنشيط حبات بروميد سيانوجين سيفاروز عن طريق وزن 80 ملليغرام لكل عينة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
أضف خمسة ملليلترات من حمض الهيدروكلوريك أحادي المللي. ماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات لتسهيل إعادة تعليق الخرز المجفف ، ثم املأ الأنبوب المخروطي ب 8.5 ملليلتر إضافي من حمض الهيدروكلوريك أحادي الملليل. قم بتدوير الخرز عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز دوار.
جهاز الطرد المركزي للخرز في 200x G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وإزالة supernatant عن طريق الطموح. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاقتران إلى لوحة الخرز ، ثم انقل تعليق الخرز إلى أنبوب طرد مركزي جديد بمقدار مليلترين وضعه جانبا. لاقتران الأجسام المضادة بهذه الخرز ، أضف ملليغرامين من الجسم المضاد المحدد في أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة مليلترين وقم بتكوين الحجم إلى ملليلتر واحد بمحلول عازل اقتران للحصول على تركيز نهائي قدره ملليغرام لكل ملليلتر.
انقل محلول الخرزة المعد مسبقا وأضفه إلى محلول الأجسام المضادة. ثم قم بتدوير أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق بسرعة 20 دورة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة باستخدام جهاز دوار ، وقم بطرد الخرز مركزيا ، ثم قم بإزالة supernatant كما هو موضح سابقا. الآن ابدأ في حجب وغسل الخرز عن طريق إضافة ملليلتر واحد من الجليسين المولي 0.2 إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على الخرز المقترن بالأجسام المضادة ، والدوران عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز دوار.
بعد الطرد المركزي وإزالة supernatant ، اغسل الخرز باستخدام PBS ملليلتر واحد ، وقم بإزالة المادة الفائقة عن طريق الطرد المركزي ، وقم بتخزين الخرز في ملليلتر واحد من PBS عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. لعزل الببتيدات من الفئة الأولى أو الثانية من MHC ، قم بإذابة لوحة مجمدة من 100 مليون خلية عن طريق تسخين قاع الأنبوب براحة اليد. أضف 500 ميكرولتر من PBS إلى اللوحة وقم بالماصة لأعلى ولأسفل حتى يصبح التعليق متجانسا.
انقل التعليق في أنبوب طرد مركزي صغير جديد بمليلترين وأضف حجما متساويا من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا. قم بالتدوير عند 10 دورات في الدقيقة لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية باستخدام جهاز دوار. جهاز الطرد المركزي تتحلل الخلية عند 18000x G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية مع الفرامل الكاملة ، ونقل supernatant في أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 2 ملليلتر.
استعادة الخرز المقترن بالأجسام المضادة عن طريق الطرد المركزي وإزالة supernatant. بعد ذلك ، انقل الخلية المحللة الفائقة إلى الخرز المقترن بالأجسام المضادة ، واحتضنها عند 10 دورات في الدقيقة لمدة 14 إلى 18 ساعة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية باستخدام جهاز دوار. في اليوم الثاني ، قم بإزالة الغطاء السفلي لعمود البولي بروبيلين ، وضع العمود على رف عمود البولي بروبيلين ، وقم بتثبيت حاوية فارغة تحته لجمع التدفق.
الآن شطف عمود البولي بروبلين مع 10 ملليلتر من المخزن المؤقت A والسماح له بالتصريف عن طريق الجاذبية. إذا كانت سرعة تدفق السائل بطيئة للغاية ، فقم بقطع الطرف السفلي من عمود البولي بروبيلين. قياس وجمع خليط الخرز / ليسات ونقله إلى عمود البولي بروبلين.
دع الخليط السائل يزول عن طريق الجاذبية. اختياريا ، قم بجمع وتجميد 20 ميكرولتر من aliquot للنشاف الغربي. الآن اغسل الخرز المحتفظ به في عمود البولي بروبيلين عن طريق إضافة 10 ملليلتر من المخزن المؤقت A واتركه يتخلص من الجاذبية.
قم بإزالة عمود البولي بروبيلين من الحامل وضعه أعلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد بحجم مليتين ، مع تثبيت العمود والأنبوب باليد. أضف 300 ميكرولتر من 1٪ TFA إلى عمود البولي بروبيلين واخلط الخرز عن طريق الأنابيب لأعلى ولأسفل خمس مرات. ثم انقل الإيلوات في أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة مليمترين.
لتحلية وإزالة ببتيدات MHC ، أضف 200 ميكرولتر من الميثانول فوق عمود C-18 وجهاز طرد مركزي عند 1،546x G لمدة ثلاث دقائق للتخلص من التدفق. أضف 200 ميكرولتر من 80٪ أسيتونيتريل في 0.1٪ TFA أعلى عمود C-18 ومرة أخرى جهاز طرد مركزي للتخلص من التدفق. ثم أضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA ، مع التخلص من التدفق عن طريق الطرد المركزي.
أخيرا ، قم بتحميل 200 ميكرولتر من مجمعات الببتيد MHC أعلى عمود C-18 ، وتخلص من التدفق عن طريق الطرد المركزي ، وكرر حتى يتم تحميل الحجم الكامل. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA ، وأجهزة طرد مركزي للتخلص من التدفق ، ونقل عمود C-18 إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد بسعة 2 ملليلتر ، وببتيدات MHC عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من 28٪ أسيتونيتريل في 0.1٪ TFA. بعد الطرد المركزي ، قم بجمع التدفق في أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 ملليلتر.
كرر عملية الحذف مرتين للحصول على حجم إجمالي قدره 450 ميكرولتر ، وقم بالتجميد عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم تحليله بواسطة LC-MS-MS. استخدم هذه الببتيدات النقية لتحديد الببتيدات من الفئة الأولى والثانية من MHC في مقياس الطيف الكتلي. وقد تجلت كفاءة ربط الخرز من خلال انخفاض كبير في شدة تلطيخ الإشارة للسلاسل الخفيفة والثقيلة عندما تكون الخرز مرتبطة تساهميا بحبات CNBr ، مقارنة بالجسم المضاد قبل الاقتران.
تم تأكيد عزل مجمعات الببتيد MHC بعد الإزالة الحمضية من خلال إشارة الكشف القوية لمجمعات الببتيد MHC باستخدام الأجسام المضادة الثقيلة السلسلة المضادة HAL-ABC. وقدرت أيضا إمكانية تكرار النتائج باستخدام البروتوكول الحالي داخل الأفراد وفيما بينهم. كان متوسط معامل التباين لعدد الببتيدات المكتشفة عبر ثلاث نسخ بيولوجية مختلفة صغيرا ، والذي تراوح من 1.9 إلى 11٪ ومع ذلك ، تباينت هوية الببتيدات بشكل كبير ، وتراوحت نسبة الببتيدات المكتشفة بشكل متكرر عبر ثلاثة مكررات بيولوجية من 39٪ إلى 63٪ أظهرت الخرائط الحرارية المتولدة قوة ارتباط MHC المتوقعة للببتيدات المحددة.
بالنسبة للببتيدات من الفئة الأولى والفئة الثانية من الفأرة MHC ، كانت المجلدات القوية أو الضعيفة المسندة 89 و 87٪ على التوالي. بالنسبة للببتيدات البشرية من الفئة الأولى والثانية من HLA ، كانت المجلدات القوية أو الضعيفة المسندة 97 و 70٪ على التوالي. كما تم توليد زخارف ربط الببتيد للفأر والإنسان للببتيدات من الفئة الأولى والثانية من LHC.
قبل تحسين هذا البروتوكول ، كان عزل الببتيدات الفئران MHC من الفئة الأولى والثانية أكثر صعوبة. سيسهل هذا البروتوكول الأمثل عزل الببتيدات الفئرانية MHC من الفئة الأولى والثانية من نماذج الفئران في الجسم الحي ، على سبيل المثال ، المستخدمة بشكل روتيني للتحقق من صحة العديد من الدراسات المتنوعة المتعلقة بالأمراض.
