Este protocolo es importante porque es sencillo de realizar y al alcance de cualquier laboratorio. Este protocolo permite el aislamiento de péptidos HLA o MHC tipo I o tipo II a partir de muestras humanas o de ratón. Este método puede abordar preguntas científicas relacionadas con todas las áreas de investigación relacionadas con el sistema inmunológico, ya sea en cáncer, virología o enfermedades autoinmunes.
Este protocolo fue construido para ser accesible a cualquier persona que trabaje en un laboratorio de investigación. Simplemente siga los pasos. Comience a activar las perlas de bromuro de cianógeno de Sepharose pesando 80 miligramos por muestra y transfiriéndolas a un tubo cónico de 15 mililitros.
Agregue cinco mililitros de ácido clorhídrico de un milimolar. Pipetee hacia arriba y hacia abajo cinco veces para facilitar la resuspensión de las perlas secas, y luego llene el tubo cónico con 8,5 mililitros adicionales de ácido clorhídrico de un milimolar. Gire las perlas a 20 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente utilizando un dispositivo rotador.
Centrifugar las perlas a 200x G durante dos minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante por aspiración. Agregue 500 microlitros de tampón de acoplamiento a la paleta de perlas, luego transfiera la suspensión de cuentas a un nuevo tubo de centrífuga de dos mililitros y déjelo a un lado. Para acoplar los anticuerpos a estas perlas, agregue dos miligramos del anticuerpo seleccionado en un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros y aumente el volumen a un mililitro con una solución tampón de acoplamiento para obtener una concentración final de dos miligramos por mililitro.
Transfiera la solución de perlas previamente preparada y agréguela a la solución de anticuerpos. Luego, gire el tubo de la microcentrífuga a 20 RPM durante 120 minutos con un dispositivo rotador, centrífique las perlas y luego retire el sobrenadante como se describió anteriormente. Ahora comience a bloquear y lavar las perlas agregando primero un mililitro de glicina molar 0.2 al tubo de la microcentrífuga que contiene las perlas acopladas a anticuerpos, y girando a 20 RPM durante 60 minutos a temperatura ambiente usando un dispositivo rotador.
Después de centrifugar y quitar el sobrenadante, lave las perlas con un mililitro PBS, retire el sobrenadante por centrifugación y guarde las perlas en un mililitro de PBS a cuatro grados Celsius hasta su uso. Para aislar los péptidos MHC de clase I o II, descongele una paleta congelada de 100 millones de células calentando la parte inferior del tubo con una palma. Agregue 500 microlitros de PBS a la paleta y pipetee hacia arriba y hacia abajo hasta que la suspensión sea homogénea.
Transfiera la suspensión en un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros y agregue un volumen igual de tampón de lisis celular. Gire a 10 RPM durante 60 minutos a cuatro grados centígrados con un dispositivo rotador. Centrifugar la célula lisar a 18, 000x G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius con el freno completo, y transferir el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Recuperar las perlas acopladas a anticuerpos por centrifugación y eliminando el sobrenadante. Luego, transfiera el sobrenadante de lisado celular a las perlas acopladas a anticuerpos e incube a 10 RPM durante 14 a 18 horas durante la noche a cuatro grados Celsius usando un dispositivo rotador. En el segundo día, retire la tapa inferior de la columna de polipropileno, coloque la columna en el estante de columnas de polipropileno e instale un recipiente vacío debajo para recoger el flujo.
Ahora enjuague la columna de polipropileno con 10 mililitros de tampón A y déjela drenar por gravedad. Si la velocidad de flujo de la elución del líquido es demasiado lenta, corte aún más la punta inferior de la columna de polipropileno. Mida y recoja la mezcla de perlas/lisado y transfiérala a la columna de polipropileno.
Deje que la mezcla líquida eluya por gravedad. Opcionalmente, recolecte y congele 20 microlitros de alícuota para Western blotting. Ahora lave las perlas retenidas en la columna de polipropileno agregando 10 mililitros de tampón A y dejándolo eluir por gravedad.
Retire la columna de polipropileno de la rejilla y colóquela en la parte superior de un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros, sosteniendo la columna y el tubo juntos con la mano. Agregue 300 microlitros de 1% TFA a la columna de polipropileno y mezcle las perlas subiendo y bajando cinco veces. Luego, transfiera el eluido en un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros.
Para desalinizar y liberar los péptidos MHC, agregue 200 microlitros de metanol en la parte superior de la columna C-18 y centrífuga a 1, 546x G durante tres minutos para descartar el flujo. Agregue 200 microlitros de 80% de acetonitrilo en 0.1% TFA en la parte superior de la columna C-18 y nuevamente centrífuga para descartar el flujo. Luego, agregue 200 microlitros de 0.1% TFA, descartando el flujo a través por centrifugación.
Finalmente, cargue 200 microlitros de los complejos peptídicos MHC en la parte superior de la columna C-18, descarte el flujo por centrifugación y repita hasta que se cargue el volumen completo. A continuación, agregue 200 microlitros de 0.1% TFA, centrífuga para descartar el flujo, transfiera la columna C-18 a un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros y eluya péptidos MHC agregando 150 microlitros de 28% acetonitrilo en 0.1% TFA. Después de la centrifugación, recoja el flujo en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Repita el proceso de elución dos veces para un volumen total de 450 microlitros y congele a menos 20 grados centígrados hasta que lc-MS-MS lo analice. Utilice estos péptidos purificados para la identificación de péptidos MHC de clase I y II en un espectrómetro de masas. La eficiencia de unión de las perlas se ilustró con una disminución significativa en la intensidad de tinción de la señal de las cadenas ligeras y pesadas cuando las perlas se unen covalentemente a las perlas CNBr, en comparación con el anticuerpo antes del acoplamiento.
El aislamiento de los complejos peptídicos MHC después de la elución ácida fue confirmado por la fuerte señal de detección de los complejos peptídicos MHC utilizando anticuerpos de cadena pesada anti-HAL-ABC. También se estimó la reproducibilidad intra e interindividual de los resultados utilizando el protocolo actual. El coeficiente de variación promedio para el número de péptidos detectados en tres réplicas biológicas diferentes fue pequeño, que varió de 1.9 a 11%Sin embargo, la identidad de los péptidos varió considerablemente, y la proporción de péptidos detectados reproduciblemente en tres réplicas biológicas varió de 39% a 63%Los mapas de calor generados mostraron la fuerza de unión MHC predicha de los péptidos identificados.
Para los péptidos MHC de clase I y clase II del ratón, los aglutinantes fuertes o débiles predicados fueron 89 y 87% respectivamente. Para los péptidos humanos HLA clase I y clase II, los aglutinantes fuertes o débiles predicados fueron 97 y 70% respectivamente. También se generaron los motivos de unión peptídica del ratón y el humano para los péptidos LHC clase I y clase II.
Antes de la optimización de este protocolo, el aislamiento de péptidos murinos MHC clase I y II era bastante más difícil. Este protocolo optimizado facilitará el aislamiento de péptidos murinos MHC clase I y II de modelos de ratón in vivo, por ejemplo, utilizados rutinariamente para la validación de muchos estudios diversos relacionados con la enfermedad.
