هنا ، نقدم سير عمل يتضمن أفضل طريقة للمعلوماتية الحيوية لإجراء التجارب لتقييم تأثير الغليفوسات على الميكروبات. الميزة الرئيسية هي أنها توفر فرضية قوية قابلة للاختبار للتجارب الميدانية والمعملية المستقبلية. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة على مجموعة متنوعة من الأنظمة ، بما في ذلك النباتات والحيوانات والميكروبات.
كل جزء من المنهجية واضح تماما. ربما يكون الجزء الأكثر تحديا هو دمج فريق متعدد التخصصات قادر على أداء أجزاء مختلفة من العمل. سيوضح الإجراء سوني ماثيو ، باحث من مختبري.
للبدء ، ابدأ التجربة الأولى عن طريق تقسيم الحقل التجريبي إلى 10 نسخ طبق الأصل من التحكم ومعالجة GBP مع شرائط عازلة من النباتات بين المؤامرات. تعامل مع قطع التحكم بمياه الصنبور وقطع أراضي الجنيه الإسترليني بالجنيه الإسترليني التجاري لتقليد الحد الأقصى المسموح به من جرعة الغليفوسات المسموح بها في الممارسات الزراعية. عينة من الميكروبات من النباتات التجريبية.
جمع 10 نسخ طبق الأصل من عينات النبات من الحقل ، ووضعها على الفور على الجليد وإحضارها إلى المختبر لمزيد من المعالجة. بالنسبة للتجربة الثانية ، اجمع الفراش ، بما في ذلك نجارة الخشب والبراز وبعض الأعلاف المنسكبة من السمان التي تتغذى على الأعلاف الملوثة أو الملوثة بالجنيه الإسترليني في تجربة قفص مدتها 12 شهرا. أرسل عينات الفراش إلى مختبر معتمد لقياسات تركيز الغليفوسات مباشرة بعد انتشاره.
زرع العشب المعمر ونباتات الفراولة في كل قطعة أرض لدراسة الميكروبات الجذرية والأوراق. تحديد وإزالة الميكروبات الداخلية عن طريق غسل وتعقيم عينات النبات. بمجرد تعقيم العينات، قم باستخراج الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي النباتية المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
باستخدام نهج متداخل ، قم بتضخيم المناطق المتغيرة من V6 إلى V8 من جين 16S rRNA وقم بعمل مزيج رئيسي PCR للعدد المطلوب من العينات كما هو موضح في مخطوطة النص. بالنسبة للجولة الأولى من PCR ، استخدم الاشعال 799 إلى الأمام و 1492 إلى الخلف. قم بإعداد ملف تعريف التضخيم في جهاز التدوير الحراري لمدة 35 دورة.
للتحقق من التضخيم ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي باستخدام خمسة ميكرولترات من المنتج المضخم ثم قم بتخفيف ما تبقى من 25 ميكرولتر من منتج PCR في ماء فائق النقاء معقم بنسبة واحد إلى 10. باستخدام الاشعال العالمية 1062 إلى الأمام و 1390 إلى الخلف ، قم بإجراء الجولة الثانية من التضخيم مع 25 دورة. تمييع منتجات PCR الناتجة في المياه فائقة النقاء المعقمة بنسبة متساوية.
قم بتنفيذ الجولة الثالثة من التضخيم بثماني دورات لوضع علامة على المنتجات باستخدام الرموز الشريطية وتسلسل محول P1. تحقق من التركيز في جودة منتجات PCR على محلل حيوي وتجميع الأحجام التي تشكل 30 نانوغرام من الحمض النووي لكل عينة في أنبوب 1.5 ملليلتر لإعداد مكتبة متساوية المول. حدد الأمبليونات ذات الحجم 350 إلى 550 زوجا أساسيا حسب تجزئة الحجم باستخدام نظام اختيار حجم الحمض النووي الآلي على كاسيت هلام الأغاروز.
اجمع العود الذي يحتوي على الأمبليونات ذات الحجم المحدد في قارورة في الكاسيت مما أدى إلى مكتبة جينات 16S rRNA منقية. انقل المحلول الذي تم جمعه إلى أنبوب 1.5 ملليلتر وتحقق من النقاء والتركيز على المحلل الحيوي. قم بتخفيف مكتبة الحمض النووي باستخدام الماء فائق النقاء المعقم إلى تركيز نهائي يبلغ 26 بيكومولار.
لتضخيم منطقة ITS ، بعد إعداد التفاعل باستخدام الاشعال ITS ، قم بتعيين ملف تعريف التضخيم على جهاز التدوير الحراري. ثم قم بتحليل خمسة ميكرولترات من المنتج المضخم على هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪ وقم بتخفيف الميكرولترات المتبقية من المنتج بنسبة واحد إلى 10 باستخدام مياه فائقة النقاء معقمة. اصنع مزيجا رئيسيا من PCR للعدد المطلوب من العينات باستخدام الاشعال الأمامية الموسومة بالرمز الشريطي والاشعال العكسي الموسومة بمحول P1.
باستخدام منتج PCR المخفف كقالب ، قم بإجراء الجولة الثانية من التضخيم. على غرار إعداد المكتبة لجين 16S rRNA ، قم بإعداد المكتبة لمنطقة ITS النقية. بدء تحليلات المعلوماتية الحيوية لتسلسل بروتين EPSPS.
تقييم الحساسية المحتملة لتسلسل الاستعلام للغليفوسات من المخرجات المقدمة من الخادم حيث يظهر الناتج الأول جزء علامات الأحماض الأمينية الموجودة في تسلسلات الاستعلام وعدد الزخارف. يعرض الناتج الثاني محاذاة الاستعلام والتسلسلات المرجعية استنادا إلى بقايا العلامات. يعرض الناتج الثالث المحاذاة الكاملة للاستعلام والتسلسلات المرجعية.
ويبين الناتج الرابع تسلسلات EPSPS المرجعية لضمة الكوليرا، وكوكسيلا بورنيتي، وبريفونديموناس حويصلة، وستربتومايسيس دافاوينسيس. في نهاية صفحة الإخراج ، ابحث عن ارتباطات إلى أدوات خارجية مثل BLASTp والمجالات المحفوظة لمزيد من التحليل لتسلسل EPSPS للاستعلام. بعد تحديد تسلسلات EPSPS من المستودعات العامة ، قم بالوصول إلى مجموعات البيانات هذه من الصفحة الرئيسية لخادم فئة EPSPS التي تحتوي على معلومات تصنيفية وفئة EPSPS التي تزيد عن 50،000 تسلسل.
وزن الكتلة الحيوية فوق سطح الأرض للنباتات في نهاية موسم الحقل لمقارنة نمو النباتات بالجنيه الإسترليني وقطع أراضي التحكم. في جدول بيانات، قم بتعيين وحدات OTUs البكتيرية لتجارب الميكروبيوم في مجموعات بيانات محسوبة مسبقا. وبناء على درجة احتمالية ، احسب الحساسية الجوهرية للغليفوسات.
تم استخدام هذه الطريقة لقياس التغيرات في الحساسية في بروتين EPSPS على المستوى التطوري الجزئي. حددنا التغيرات في حالة الحساسية في 12 من أصل 32 مجموعة وثيقة الصلة من بدائيات النوى التي تم تحليلها. وبالتالي ، فإن الاستخدام المستمر للمنتجات القائمة على الغليفوسات قد ينتج dysbiosis الميكروبي في ميكروبات النبات والحيوان والتربة.
ضمان جودة إجراءات ما قبل وبعد تفاعل البوليميراز المتسلسل للحصول على مكتبات أمبليكون مثالية. تأكد أيضا من أن تسلسل بروتين EPSPS ليس جزئيا قبل استخدام البرنامج. في التجارب الميدانية ، تأكد من منع تلوث عناصر التحكم بالغليفوسات.
