Aquí, proporcionamos un flujo de trabajo que incluye el mejor método bioinformático para realizar los experimentos para evaluar el efecto del glifosato en los microbiomas. La principal ventaja es que proporciona una hipótesis robusta y comprobable para futuros experimentos de campo y laboratorio. La metodología descrita se puede aplicar a una variedad de sistemas, incluyendo plantas, animales y microbios.
Cada parte de la metodología es bastante sencilla. Quizás la parte más desafiante es integrar un equipo multidisciplinario capaz de realizar diferentes partes del trabajo. Demostrando el procedimiento estará Suni Matthew, un investigador de mi laboratorio.
Para comenzar, comience el experimento uno dividiendo el campo experimental en 10 réplicas de control y tratamiento GBP con franjas tampón de vegetación entre las parcelas. Trate las parcelas de control con agua del grifo y las parcelas GBP con GBP comercial para imitar la dosis máxima permitida de glifosato en las prácticas agrícolas. Muestree la microbiota de plantas experimentales.
Recolecte 10 réplicas de las muestras de plantas del campo, colóquelas inmediatamente en hielo y llévelas al laboratorio para su posterior procesamiento. Para el segundo experimento, recoja camas, incluidas virutas de madera, heces y algo de alimento derramado de codornices alimentadas con GBP contaminadas o alimentos de control en un experimento de aviario de 12 meses. Envíe las muestras de ropa de cama a un laboratorio acreditado para las mediciones de concentración de glifosato directamente después de que se extienda.
Planta plantas perennes de hierba y fresa en cada parcela para estudiar su microbiota radicular y foliar. Identifique y elimine los microbios endófitos lavando y esterilizando las muestras de plantas. Una vez esterilizadas las muestras, extraiga el ADN genómico utilizando un kit de extracción de ADN vegetal disponible comercialmente siguiendo el protocolo del fabricante.
Utilizando un enfoque anidado, amplifique las regiones variables V6 a V8 del gen 16S rRNA y haga una mezcla maestra de PCR para el número requerido de muestras como se describe en el manuscrito de texto. Para la primera ronda de PCR, use imprimaciones 799 hacia adelante y 1492 hacia atrás. Configure el perfil de amplificación en el termociclador durante 35 ciclos.
Para verificar la amplificación, realice la electroforesis utilizando cinco microlitros de producto amplificado y luego diluya los 25 microlitros restantes del producto de PCR en agua ultrapura en autoclave en la proporción de uno a 10. Utilizando los cebadores universales 1062 hacia adelante y 1390 hacia atrás, realice la segunda ronda de amplificación con 25 ciclos. Diluya los productos de PCR resultantes en agua ultrapura en autoclave en una proporción igual.
Realice la tercera ronda de amplificación con ocho ciclos para etiquetar los productos con los códigos de barras y la secuencia del adaptador P1. Verificar la concentración en calidad de los productos de PCR en un bioanalizador y agrupar los volúmenes que constituyen 30 nanogramos de ADN de cada muestra en un tubo de 1,5 mililitros para preparar una biblioteca equimolar. Seleccione los amplicones de tamaño 350 a 550 pares de bases por fraccionamiento de tamaño utilizando un sistema automatizado de selección de tamaño de ADN en un casete de gel de agarosa.
Recoja el eluido que contiene los amplicones del tamaño especificado en un vial en el casete, lo que resulta en una biblioteca de genes 16S rRNA purificada. Transfiera el eluyente recolectado a un tubo de 1,5 mililitros y verifique la pureza y la concentración en el bioanalizador. Diluya la biblioteca de ADN utilizando agua ultrapura en autoclave a una concentración final de 26 picomolares.
Para amplificar la región ITS, después de configurar la reacción con cebadores ITS, establezca el perfil de amplificación en el termociclador. Luego analice cinco microlitros del producto amplificado en gel de agarosa al 1.5% y diluya los 25 microlitros restantes del producto en la proporción de uno a 10 usando agua ultrapura en autoclave. Haga una mezcla maestra de PCR para el número requerido de muestras con imprimaciones delanteras etiquetadas con códigos de barras y imprimaciones inversas etiquetadas con el adaptador P1.
Utilizando el producto de PCR diluido como plantilla, realice la segunda ronda de amplificación. Similar a la preparación de la biblioteca para el gen 16S rRNA, prepare la biblioteca para la región ITS purificada. Iniciar los análisis bioinformáticos de la secuencia de proteínas EPSPS.
Evaluar la sensibilidad potencial de la secuencia de consulta al glifosato desde el servidor proporcionó resultados donde la salida uno muestra la fracción de marcadores de aminoácidos presentes en las secuencias de consulta y el número de motivos. La salida dos muestra alineaciones de las secuencias de consulta y referencia basadas en residuos de marcadores. La salida tres muestra alineaciones completas por pares de las secuencias de consulta y referencia.
La salida cuatro muestra secuencias de referencia EPSPS de Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis y Streptomyces davawensis. Al final de la página de salida, busque enlaces a herramientas externas como BLASTp y dominios conservados para analizar más a fondo la secuencia EPSPS de consulta. Después de identificar las secuencias EPSPS de los repositorios públicos, acceda a estos conjuntos de datos desde la página principal del servidor de clases EPSPS que contiene información taxonómica y la clase EPSPS de más de 50.000 secuencias.
Pesar la biomasa sobre el suelo de las plantas al final de la temporada de campo para comparar el crecimiento de las plantas en GBP y las parcelas de control. En una hoja de cálculo, asigne las OTU bacterianas para experimentos de microbioma en conjuntos de datos precalculados. Y en base a una puntuación probabilística, calcule la sensibilidad intrínseca al glifosato.
Este método se utilizó para cuantificar los cambios en la sensibilidad en la proteína EPSPS a un nivel microevolutivo. Se identificaron cambios en el estado de sensibilidad en 12 de los 32 grupos estrechamente relacionados de procariotas analizados. Por lo tanto, el uso continuo de los productos a base de glifosato puede producir disbiosis microbiana en los microbiomas de plantas, animales y suelos.
Asegurar la calidad de los procedimientos pre y post-PCR para obtener bibliotecas de amplicon óptimas. También asegúrese de que la secuencia de proteínas EPSPS no sea parcial antes de usar el software. En los experimentos de campo, asegúrese de evitar la contaminación de los controles con glifosato.
