الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل وتوصيف الأنسجة الدهنية الحمراء والخلايا الجذعية الوسيطة المجففة وتمييزها نحو الخلايا المنتجة للأنسولين باستخدام طرق بسيطة. وقد وجدت الخلايا الجذعية الوسيطة الطرق في مجال علم الوراثة. يمكن عزلها من مصادر مختلفة مثل نخاع العظام والأنسجة الدهنية والأنسجة المحيطة بالولادة.
إنهم يقبلون الخصائص الثقافية الممتازة. فهي متعددة القدرات ويمكن أن تعالج الأمراض المختلفة. توفر الأنسجة الدهنية مصدرا غنيا للخلايا الجذعية الوسيطة.
يمكن عزل هذه MSCs الدهنية من شفط الدهون بسهولة مع غلة عالية مقارنة بمصادر أخرى مثل نخاع العظام. ويمكن أن توفر مصدرا جيدا لكل من الزرع الذاتي والوجيني. في هذا الفيديو ، يتم تقديم بروتوكول بسيط لعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية من الدهون البربخية للفئران.
هذا الإجراء هو طريقة بسيطة عالية الكفاءة للعزل. بعد العزلة ، سنتحمل تمايز هذه الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية إلى خلايا منتجة للأنسولين باستخدام بروتوكول بسيط وقصير نسبيا. سنبدأ بعزل الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية عن طريق هضم الكولاجين للدهون البربخية للحصول على جزء وعائي أقوى.
ثم ستتميز الخلايا الجذعية الوسيطة بالالتصاق البلاستيكي ، وكذلك التعبير عن علامات CD والتمايز إلى سلالات متعددة من الجلد المتوسط. Anaesthise الحيوان ، ثم القتل الرحيم باستخدام خلع عنق الرحم. رش في جميع أنحاء الجسم مع 70 ٪ من الإيثانول والبدء مع استئصال الجلد والعضلات في الجزء السفلي من البطن.
ثم فضح الخصيتين بالدهون البربخية. قطع بلطف الدهون البربخ. احرص على عدم قطع الأوعية الدموية بالدهون.
في خزانة السلامة الحيوية ، قم بقطع الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة باستخدام الملقط والمشرط. نقل الأنسجة الدهنية إلى أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على 10 ملليلتر PBS معقم. ابدأ الغسيل عن طريق إمالة أنبوب فالكون لمدة 45 ثانية.
ثم حافظ على الأنبوب واقفا لمدة خمس دقائق لفصله إلى طبقتين. قم بإزالة PBS المتخلل باستخدام حقنة 10 ملليلتر. كرر خطوات الغسيل هذه من أربع إلى خمس مرات حتى يصبح PBS واضحا.
بعد الغسيل ، أعد تعليق الأنسجة الدهنية في محلول الكولاجين ، ثم احتضنها في حمام مائي مهتز حتى يصبح النسيج متجانسا تقريبا. بعد ذلك ، دوامة خليط الكولاجين الأنسجة لمدة 15 ثانية ، ثم جهاز الطرد المركزي بعد ذلك لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، سيكون لديك ثلاث طبقات.
تخلص بعناية من السوبرناتانت فوق الجزء الوعائي اللحمى. تخلص أولا من طبقة الزيت في الأعلى بعناية ، تليها طبقة الأصداء دون إزعاج حبيبات الكسر الوعائي اللدود. أعد تعليق الجزء الوعائي Stromal في BSA المعقم وأعد جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق.
الطرد المركزي كله ، ضع وسائط DMEM F-12 كاملة في قارورة مربعة 25 سم. بعد الطرد المركزي ، تخلص من السوبرناثان وأعد تعليق الكريات الوعائية اللحمية في وسائط DMEM F-12 الكاملة. ونقلها إلى قارورة الثقافة.
مكان في 37 درجة 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإزالة الخلايا غير المرفقة واستبدل الوسائط بوسائط جديدة. بدءا من اليوم التالي من العزلة ، ستبدأ الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية في الظهور.
ثم تدريجيا مع مرور الوقت سوف تزداد في العدد والحجم. عن طريق المرور ، ستصبح الخلايا أكثر تجانسا. تظهر هذه الخلايا جميع معايير توصيف الخلايا الجذعية الوسيطة.
تم تمييز هذه الخلايا نحو الخلايا المنتجة للأنسولين باستخدام هذا البروتوكول البسيط الذي يحتوي على نيكوتيناميد بيتا ميركابتوإيثانول وإكسيندين-4. خلال خطوات التمايز ، تبدأ الخلايا في فقدان شكلها الليفي وأعتقد أنها تتجمع مثل المورفولوجيا. عند استخدام الخلايا المنتجة للأنسولين تظهر تلطيخا إيجابيا للديسيثون الأحمر القرمزي ، فإن الخلايا المنتجة للأنسولين المستخدمة تعبر عن علامات خلايا بيتا المختلفة مثل Pdx-1 و mafA والأنسولين.
بالإضافة إلى ذلك ، تفرز الخلايا المنتجة للأنسولين المستحثة مستويات أعلى من الأنسولين في supernatant عند تحديها بتركيز أعلى من الجلوكوز. قدمنا بروتوكولا مفصلا وتدريجيا لعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية. كما نقدم هنا بروتوكولا قصيرا وبسيطا وفعالا نسبيا لتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة الدهنية إلى خلايا منتجة للأنسولين.
وهذا يوفر بوابة للباحث لدخول مجال الخلايا الجذعية الوسيطة ودراسة تمايزها إلى خلايا منتجة للأنسولين.
