L’objectif global de ce protocole est d’isoler et de caractériser le tissu adipeux rouge, les cellules souches mésenchymateuses séchées et de les différencier en cellules productrices d’insuline à l’aide de méthodes simples. Les cellules souches mésenchymateuses ont trouvé les voies dans le domaine de la génétique. Ils peuvent être isolés à partir de diverses sources telles que la moelle osseuse, le tissu adipeux et le tissu périnatal.
Ils acceptent d’excellentes caractéristiques culturelles. Ils sont multi-puissants et peuvent potentiellement traiter diverses maladies. Le tissu adipeux fournit une riche source de cellules souches mésenchymateuses.
Ces CSM adipeux peuvent être isolés facilement des lipoaspirats avec un rendement élevé par rapport à d’autres sources comme la moelle osseuse. Et ils peuvent fournir une bonne source pour la transplantation autologue et allogénique. Dans cette vidéo présentent un protocole simple pour l’isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses de la graisse épididymale de rat.
Cette procédure est une méthode simple et très efficace pour l’isolement. Après isolement, nous subirons la différenciation de ces cellules souches mésenchymateuses adipeuses en cellules productrices d’insuline à l’aide d’un protocole simple et relativement court. Nous commencerons par l’isolement des cellules souches mésenchymateuses adipeuses par digestion collagène de la graisse épididymale pour obtenir une fraction vasculaire plus forte.
Ensuite, les cellules souches mésenchymateuses seront caractérisées par leur adhérence plastique, ainsi que par l’expression de marqueurs CD et la différenciation en plusieurs lignées mésodermiques. Anesthésier l’animal, puis l’euthanasier en utilisant la luxation cervicale. Vaporisez sur tout le corps avec 70% d’éthanol et commencez par l’excision de la peau et des muscles de la partie inférieure de l’abdomen.
Ensuite, exposez les testicules avec la graisse épididymale. Coupez doucement la graisse épididymale. Veillez à ne pas couper les vaisseaux sanguins avec les graisses.
Dans une armoire de biosécurité, coupez le tissu adipeux en petits morceaux à l’aide d’une pince et d’un scalpel. Transférer le tissu adipeux dans un tube centrifuge contenant 10 millilitres de PBS stérile. Commencez le lavage en inclinant le tube Falcon pendant 45 secondes.
Ensuite, gardez le tube debout pendant cinq minutes pour le séparer en deux couches. Retirez le PBS infrané à l’aide d’une seringue de 10 millilitres. Répétez ces étapes de lavage quatre à cinq fois jusqu’à ce que PBS soit clair.
Après le lavage, remettez en suspension le tissu adipeux dans une solution collagène, puis incubez au bain-marie jusqu’à ce que le tissu soit presque homogène. Ensuite, vortex le mélange de collagène tissulaire pendant 15 secondes, puis centrifuger ensuite pendant cinq minutes. Après centrifugation, vous aurez trois couches.
Jetez soigneusement le surnageant sur la fraction vasculaire stromale. Jetez d’abord soigneusement la couche d’huile en haut, suivie de la couche d’échos sans perturber la pastille de fraction vasculaire stromale. Re-suspendre la fraction vasculaire stromale dans le BSA stérile et re-centrifuger pendant cinq minutes.
Centrifugation entière, placez le support DMEM F-12 complet dans une fiole carrée de 25 centimètres. Après centrifugation, jeter le surnageant et suspendre à nouveau la pastille vasculaire stromale dans un milieu DMEM F-12 complet. Et transfert dans la fiole de culture.
Placer dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés 5%. Le lendemain, retirez les cellules non attachées et remplacez le média par un support frais. À partir du lendemain de l’isolement, les cellules de type fibroblaste commenceront à apparaître.
Puis, progressivement, au fil du temps, leur nombre et leur taille augmenteront. En passant, les cellules deviendront plus homogènes. Ces cellules présentent tous les critères de caractérisation des cellules souches mésenchymateuses.
Ces cellules ont été différenciées en cellules productrices d’insuline en utilisant ce protocole simple contenant du nicotinamide bêta-mercaptoéthanol et de l’exendine-4. Tout au long des étapes de différenciation, les cellules commencent à perdre leur forme fibroblastique et je pense que la morphologie des grappes. Lorsqu’elles sont utilisées, les cellules productrices d’insuline présentent une coloration positive de la disithone rouge cramoisi, puis les cellules productrices d’insuline utilisées expriment divers marqueurs de cellules bêta comme Pdx-1, mafA et insuline.
En outre, les cellules productrices d’insuline induites sécrètent des niveaux plus élevés d’insuline dans le surnageant lorsqu’elles sont confrontées à une concentration de glucose plus élevée. Nous avons fourni un protocole détaillé et par étapes pour l’isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses. Nous fournissons également ici un protocole relativement court, simple et efficace pour la différenciation des cellules souches mésenchymateuses adipeuses en cellules productrices d’insuline.
Cela fournit une passerelle aux chercheurs pour entrer dans le domaine des cellules souches mésenchymateuses et étudier leur différenciation en cellules productrices d’insuline.
