ويمكن استخدام منهجيتنا بسيطة وعملية للحصول على ADSCS وفيرة لدراسة PVAT adipogenesis في المختبر واختبار الأدوية العادية ضد السمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية ذات الصلة. وميزة هذه الطريقة هي الفلورس الكامنة من NCADSCs من البيوتين تحتاج إلى تسمية الخلايا مع الأجسام المضادة flou-chrome مترافق لFACS، أو الخلايا تنشيط المغناطيسي الفرز. يمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على اكذال من الـ ADSC المشتقة من خلايا القمة العصبية من الخلايا البكندرية لدراسة تكوين الدهون الدهنية PVAT، أو تكوين الدهون في المختبر.
استخدام الفئران الصغيرة وجود خبرة مع الكي وتولد الخلايا الدهنية المستحثة يعني 3T3 الخلايا أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول. وسوف يكون إثبات الإجراء Yiding تشي، وهو طالب غراد، وليان شو، وهو فني من مختبري. لتشريح PAAT ، بعد تعقيم الذبيحة الماوس في 75 ٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق ، استخدم المقص لقص وفصل الجلد على البطن.
قطع على طول خط الوسط البطني من الحوض إلى الرقبة، وفتح البطن. حرك الكبد لفضح الحجاب الحاجز، وقطع الحجاب الحاجز والأضلاع على جانبي خط الوسط. قشر مرة أخرى الأضلاع لفضح القلب والرئتين.
و أزل الرئتين والزعتر استخراج PAAT جنبا إلى جنب مع الشريان الأورطي والقلب في طبق بتري. وقطع الشريان الأبهر في الجذر الأبهري لإزالة القلب.
ثم، جعل قطع بين القوس الأبهر والابهرية تنازلي. يفصل بعناية الأنسجة الدهنية المحيطة بكل من الهيكلين، والشرايين السباتية المشتركة اليسرى والأيّنية من جدار الصدر الخلفي. من المهم فصل PAAT عن الجذر وكأوعية الأوعية الدموية أكبر بعناية، هو وجود خلايا جدار الأوعية الدموية يمكن أن تؤثر على كفاءة FACS.
وضع الأنسجة في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة HBSS العازلة. واستخدام ملقط العقيمة لإزالة أكبر قدر من الأوعية الدموية واللفافة قدر الإمكان. ثم، نقل الأنسجة الدهنية إلى أنبوب Eppendorf ملليلتر اثنين، تحتوي على نقطة خمسة ملليلتر من الجليد الباردة HBSS العازلة على الجليد.
عندما تم جمع كل PAAT، نقل الأنسجة الدهنية المحصودة إلى أنبوب جديد ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير يحتوي على ملليلتر واحد من هضم المتوسطة الطازجة. واستخدم مقص جراحياً لـ ينم الأنسجة نقل الطين الأنسجة في أنبوب 50 ملليمتر تحتوي على تسعة ملليلتر من الهضم الطازج المتوسطة.
واستخدم ماصة ملليلتر واحدة لتثلث الأنسجة 10 مرات. عندما تم الحصول على حل متجانس، احتضان الأنبوب لمدة 30 إلى 45 دقيقة في 37 درجة مئوية و 100 الثورات في الدقيقة الواحدة، والتحقق من كل خمس إلى 10 دقائق لمنع إفراط في عسر الهضم. عندما يمكن ملاحظة محلول الأنسجة الدهنية المتجانسة الصفراء الفاتحة عند الدوامة اللطيفة للأنبوب ، توقف عن الهضم بخمس ملليلترات من HDMEM تكملها مصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪.
بعد خلط شامل، الطرد المركزي عينة الأنسجة الدهنية. وسوف يكون جزء الخلية الوعائية stromal مرئية كما بيليه البني. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من المتوسطة الثقافة, وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 70.
جمع الخلايا عن طريق طرد مركز آخر. وبلطف إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من الخلايا الحمراء العازلة تحلل. نقل التعليق إلى أنبوب 15 ملليلتر.
بعد 10 دقائق، ووقف رد فعل مع اثنين من الطرد المركزي في 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وتستكمل مع 1٪ مصل البقر الجنين. بعد الطرد المركزي الثاني، إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المتوسطة الثقافة على الجليد. وجمع الخلايا مع الطرد المركزي النهائي.
ثم، إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت FACS للعد. لإقامة ثقافة NCADSC، بعد عزلها من قبل FACS وفقا للبروتوكولات القياسية، ووضع الخلايا في خمس مرات 10 إلى الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع التركيز في كل بئر، لوحة ثقافة 12 جيدا. غير مكتملة متوسطة الثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 إلى 24 ساعة.
في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع 37 درجة مئوية PBS، وتغذية الثقافة مع ثقافة جديدة المتوسطة. عندما تصل الثقافة إلى 80 إلى 90٪ التقاء، علاج الخلايا مع مليلتر اثنين من 0.25٪ التربسين EDTA في البئر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية. عندما يتم فصل الخلايا من الجزء السفلي من لوحة، تحييد الإنزيمات مع مليلتر اثنين من المتوسطة المستزرعة، وجمع الخلايا المحصودة عن طريق الطرد المركزي.
إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الثقافة الطازجة المتوسطة للعد. وبذِر الخلايا في لوحة جديدة 12 ثقافة جيدة في خمس مرات 10 إلى الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع التركيز. ثم، إعادة تعليق الخلايا المتبقية في المتوسط الثقافة تكمل مع 10٪ ثنائي الفينيل السلفوكسيد لتخزين المجمدة في النيتروجين السائل.
للحث على التمايز الايديبويجيني، عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ التقاء، علاج الخلايا مع البني أو الأبيض adipogenic التعريفي المتوسطة لمدة يومين حسب الاقتضاء. في نهاية الحضانة، وغسل بلطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة المناسبة adipogenic جديدة التعريفي المتوسطة لكل بئر، وإعادة الخلايا إلى الحاضنة ثقافة الخلية لمدة إضافية من ثلاثة إلى خمسة أيام من الحضانة. اللجان الوطنية للثقافة تصل إلى 80 إلى 90٪ التقاء بعد سبعة إلى ثمانية أيام من الثقافة.
وتثبت توسيع الألياف الزجاجية مثل مورفولوجيا. لمزيد من تأكيد إمكاناتها الادبويجينية، يمكن إجراء تلطيخ الزيت الأحمر من NCADSCs المتمايزة للكشف عن الخلايا الدهنية الناضجة. عادة، لوحظت adipocytes ناضجة بعد ثمانية أيام من الأبيض أو البني adipogenic التعريفي مع أكثر من 60٪ من NCADSCs عرض تمايزadipogenic.
لاحظ أن NCADSCs تظهر إلى حد كبير انخفاض adipogenic المحتملة بعد passaging. تكشف PCR المناعية والكمية في الوقت الحقيقي أن التعبير عن بروتينات جينات نسبية محددة من الناحية المحددة يزيد بشكل كبير في NCADSCs المتمايزة بشكل اديوجيني بعد ثمانية أيام من الحث الأبيض الاديبويجيني. وبالمثل، فإن التعبير عن جينات محددة من الخلايا الشحمية، والجينات المحددة الدهنية البنية، يزداد أيضا بشكل كبير بعد ثمانية أيام من الحث البنيadipogenic.
منذ معظم بروتوكول العزل NCADSC بسيطة واقتصادية، ولا تتطلب استخدام الأجسام المضادة، لذلك، فإن شدة أسباب السوائل القوية من IFP يمكن أن تحسن كفاءة التغذية FACS.
