نموذجنا العضوي ذو قيمة عالية لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية في ظروف إعادة تشكيل الغدة النخامية وكذلك في ظروف إعادة تشكيل الغدة النخامية ، مثل نضج الغدة عند حديثي الولادة ، والتدهور الوظيفي المرتبط بالشيخوخة ، ونمو الورم في الغدة. حتى الآن ، تعد تقنية الغدة النخامية العضوية لدينا هي الأداة الوحيدة المتاحة لنمو وتوسيع الخلايا الجذعية النخامية الأولية للفئران بشكل موثوق وقوي. سيوضح الإجراء إيما لابورت وشارلوت نيس ، طالبات الدكتوراه في مجموعتي البحثية.
للبدء ، اغسل رأس الماوس بالماء منزوع الأيونات لإزالة الدم. رش 70٪ من الإيثانول على الرأس لتوليد بيئة معقمة. ثم قم بإزالة الجلد بين الأذنين باستخدام أدوات جراحية معقمة.
لفتح الجمجمة ، اكسر جسر الأنف بمقص معقم. مزيد من فتح الجمجمة بدءا من جسر الأنف نحو الأذنين على كلا الجانبين. إزالة الجمجمة والدماغ مع ملاقط معقمة دون لمس الغدة النخامية.
إزالة الحجاب الحاجز sellae مع ملاقط حادة. ثم ، تحت المجهر المجسم ، افصل الفص الأمامي عن الفصوص الخلفية والوسيطة. اعزل الفص الأمامي بعناية باستخدام ملاقط حادة واجمعها في قارورة Erlenmeyer سعة 10 ملليلتر تحتوي على ثلاثة ملليلترات من A.أضف ملليلترين من محلول التربسين المسخن مسبقا بنسبة 2.5٪.
تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف ملليلترين من محلول الحمض النووي المسخن مسبقا وقم بتدوير قارورة Erlenmeyer 10 مرات. دع الغدة النخامية تغرق في القاع وإزالة supernatant.
أضف ملليلترين من محلول مثبط التربسين المسخن مسبقا واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة supernatant عندما تغرق الغدة النخامية في القاع. أضف ملليلترين من الوسط B المسخن مسبقا واحتضنه لمدة خمس دقائق.
أضف ملليلترين من الوسط C المسخن مسبقا إلى هذا واحتضنه لمدة 15 دقيقة. دع الغدة النخامية تغرق في القاع وإزالة supernatant. ثم اشطفيه ثلاث مرات بوسط C.Add ملليلتر من الوسط المسخن مسبقا C.Aspirate وطرد الغدة النخامية باستخدام ماصة باستور معقمة ومصقولة باللهب عدة مرات حتى لا تكون الشظايا مرئية بعد الآن.
انقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على 4.5 ملليلتر من محلول الحمض النووي المسخن مسبقا. شطف القارورة ثلاث مرات مع اثنين من ملليلتر من الوسط C المسخن مسبقا ونقل التعليق إلى الأنبوب. امزج تعليق الخلية الذي تم جمعه وقم بتصفيته من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب سعة 30 ملليلتر.
شطف الأنبوب ومصفاة الخلية ثلاث مرات مع اثنين من ملليلتر من C المتوسطة ونقل التعليق إلى الأنبوب. املأ ماصة باستور الزجاجية بملليلترين من BSA. ضع طرف الماصة في أسفل الأنبوب وقم بإخراجها برفق لتشكيل طبقة كثافة مرئية.
جهاز طرد مركزي عند 190 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة الخلية في ملليلتر واحد من DMEM / F-12 المتقدم على الجليد البارد. ثم، قم بقياس الخلايا باستخدام عداد خلايا.
الطرد المركزي تعليق الخلية في 190 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة supernatant. أعد تعليق حبيبات الخلايا في DMEM / F-12 المتقدم للوصول إلى كثافة خلية تبلغ 1.1 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر. أضف ECM إلى الحجم المطلوب من تعليق الخلية بنسبة 30:70 واخلطه جيدا.
قم بإيداع قطرة 30 ميكرولتر من هذا الخليط في كل بئر من صفيحة 48 بئرا تم تسخينها مسبقا. اقلب اللوحة رأسا على عقب واترك ECM يتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف بعناية 250 ميكرولتر من وسط الغدة النخامية العضوي المسخن مسبقا مع مثبط ROCK 10-micromolar.
كل يومين إلى ثلاثة أيام ، قم بتغيير الوسط بدون مثبط ROCK لمدة 10 إلى 14 يوما حتى تنمو المواد العضوية بالكامل. لتمرير المواد العضوية ، قم أولا بشفط الوسط بلطف وإضافة 400 ميكرولتر من DMEM / F-12 المتقدم من الجليد البارد لتفكيك ECM. ثم ، جمع المواد العضوية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
اغسل البئر ب 400 ميكرولتر من DMEM / F-12 المتقدم من الثلج البارد. جهاز طرد مركزي للأنبوب بسرعة 200 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الفائقة وإضافة 400 ميكرولتر من إنزيم TrypLE Express الذي تم تسخينه مسبقا.
اخلطي الأنبوب عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات واحتضنيه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أضف 400 ميكرولتر من DMEM / F-12 المتقدم من الجليد البارد. جهاز طرد مركزي بسرعة 200 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة supernatant.
أعد تعليق الكريات مع 100 ميكرولتر من DMEM / F-12 المتقدم من الجليد البارد. قم بتضييق طرف P-200 واستخدم الطرف لفصل المواد العضوية عن طريق السحب بقوة حتى يتم الحصول على شظايا عضوية. أضف 800 ميكرولتر من DMEM / F-12 المتقدم.
جهاز طرد مركزي عند 190 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة supernatant. لتمرير المواد العضوية ، أعد تعليق الكريات في حجم مناسب من DMEM / F-12 المتقدم وأضف ECM بنسبة 30: 70. تخلط جيدا.
الاستمرار في زرع وزراعة المواد العضوية كما هو موضح في مخطوطة النص. تم زرع الخلايا المفردة المنفصلة عن الفص الأمامي في ECM ونمت في وسط عضوي في الغدة النخامية. بعد 14 يوما من البذر ، تم تطوير المواد العضوية بالكامل ووصل قطرها إلى 500 ميكرومتر.
في هذه المرحلة ، أظهرت المواد العضوية مورفولوجيا كيسية مع طبقة ظهارية تحيط بتجويف. لا ينصح باستخدام الآبار التي تظهر فيها الهياكل الكثيفة بعد النمو. للمرور ، تم استخدام شظايا العضوية للبذر.
بعد سبعة أيام من المرور ، لوحظ إعادة نمو عضوي موات مع الهياكل الكيسي. يجب التخلص من المواد العضوية الكثيفة ، حيث قد تستحوذ المواد العضوية غير المواتية على الثقافة. أكد تحليل تلطيخ التألق المناعي للعلامات الظهارية E-cadherin و cytokeratins 8 و 18 الطابع الظهاري للعضويات.
أظهر التعبير عن علامات الخلايا الجذعية النخامية Sox2 و Trop2 الجذعية ، وأظهرت العلامة الخاصة بالغدة النخامية LHX3 النمط الظاهري للغدة النخامية للعضويات. أظهر التعبير عن العلامة Ki67 أن الخلايا المكونة للعضويات في حالة تكاثرية. أظهر تحليل RTQ PCR تعبيرا أعلى عن علامات الجذعية في المواد العضوية مقارنة بالفص الأمامي حتى بعد مرور عدة ، مما يؤكد صحة إثراء الخلايا الجذعية.
من المهم وضع العدد المناسب من الخلايا المفردة في قبة ECM عند البذر الأولي ، وعند تمرير المواد العضوية ، يجب على المرء أن يتذكر إعادة زرع الشظايا وليس الخلايا المفردة.
