Наша органоидная модель очень ценна для изучения биологии стволовых клеток гипофиза в условиях гомеостатического, а также гипофизарного ремоделирования, таких как неонатальное созревание железы, функциональное снижение, связанное со старением, и рост опухоли в железе. На сегодняшний день наша органоидная техника гипофиза является единственным доступным инструментом для надежного и надежного выращивания и расширения первичных стволовых клеток гипофиза мыши. Продемонстрировать процедуру будут Эмма Лапорт и Шарлотта Нис, аспиранты в моей исследовательской группе.
Для начала вымойте голову мыши деионизированной водой, чтобы удалить кровь. Распылите 70% этанола на голову для создания стерильной среды. Затем удалите кожу между ушами с помощью стерильных хирургических инструментов.
Чтобы открыть череп, разбейте переносицу стерильными ножницами. Далее откройте череп, начиная от переносицы по направлению к ушам с обеих сторон. Удаляют череп и мозг стерильным пинцетом, не касаясь гипофиза.
Удалите диафрагму селлаем тупым пинцетом. Затем под стереомикроскопом отделяют переднюю долю от задней и промежуточной долей. Осторожно изолируйте переднюю долю тупым пинцетом и соберите ее в 10-миллилитровую колбу Эрленмейера, содержащую три миллилитра среды А.Добавьте два миллилитра предварительно нагретого 2,5% раствора трипсина.
Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Добавьте два миллилитра предварительно разогретого раствора DNAse и закрутите колбу Эрленмейера 10 раз. Дайте гипофизу опуститься на дно и удалите супернатант.
Добавьте два миллилитра предварительно подогретого раствора ингибитора трипсина и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите супернатант, когда гипофиз опустится на дно. Добавьте два миллилитра предварительно подогретой среды В и высиживайте в течение пяти минут.
Добавьте к этому два миллилитра предварительно подогретой среды С и высиживайте в течение 15 минут. Дайте гипофизу опуститься на дно и удалите супернатант. Затем промыть его три раза предварительно нагретой средой C.Добавьте два миллилитра предварительно нагретой среды C.Aspirate и изгоните гипофиз стерильной, огненно-полированной пипеткой Пастера несколько раз, пока фрагменты больше не будут видны.
Переложите суспензию в 15-миллилитровую трубку, содержащую 4,5 миллилитра предварительно нагретого раствора DNAse. Промыть колбу три раза двумя миллилитрами предварительно нагретой среды С и перенести суспензию в трубку. Смешайте собранную клеточную суспензию и отфильтруйте ее через 40-микронный клеточный сетчатый фильтр в 30-миллилитровую трубку.
Промыть трубку и клеточный ситечко три раза двумя миллилитрами среды С и перенести суспензию в трубку. Наполните стеклянную пипетку Пастера двумя миллилитрами BSA. Расположите кончик пипетки в нижней части трубки и осторожно выдвиньте пипетку, чтобы сформировать видимый слой плотности.
Центрифуга в 190 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в одном миллилитре ледяного усовершенствованного DMEM/F-12. Затем количественно оцените ячейки с помощью счетчика клеток.
Центрифугируйте клеточную суспензию в 190 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и удалите супернатант. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в продвинутом DMEM/F-12 для достижения плотности клеток в 1,1 раза 10 до 6-й ячейки на миллилитр. Добавьте ECM к нужному объему клеточной суспензии в соотношении 30:70 и хорошо перемешайте.
Внесите 30-микролитровую каплю этой смеси в каждую лунку предварительно нагретой 48-луночной плиты. Переверните пластину вверх дном и дайте ECM затвердеть при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут. После инкубации осторожно добавляют 250 микролитров предварительно подогретой органоидной среды гипофиза, дополненной 10-микромолярным ингибитором ROCK.
Каждые два-три дня меняйте среду без ингибитора ROCK в течение 10-14 дней, пока органоиды не будут полностью выращены. Чтобы пройти органоиды, сначала осторожно аспирируйте среду и добавьте 400 микролитров ледяного усовершенствованного DMEM / F-12 для разрушения ECM. Затем соберите органоиды в микроцентрифужную трубку.
Промыть колодец 400 микролитрами холодного льда усовершенствованного DMEM/F-12. Центрифугируйте трубку в 200 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант и добавьте 400 микролитров предварительно подогретого фермента TrypLE Express.
Перемешайте, перевернув трубку несколько раз и высиживая при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Добавьте 400 микролитров холодного льда усовершенствованного DMEM/F-12. Центрифугируйте в 200 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите супернатант.
Повторно суспендируйте гранулы 100 микролитрами холодного усовершенствованного DMEM/F-12. Сузьте наконечник P-200 и используйте наконечник для диссоциации органоидов путем энергичной пипетки до получения фрагментов органоидов. Добавьте 800 микролитров усовершенствованного DMEM/F-12.
Центрифугу в 190 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и удалите супернатант. Для прохождения органоидов повторно суспендируют гранулу в достаточном объеме усовершенствованного DMEM/F-12 и добавляют ECM в соотношении 30:70. Хорошо перемешать.
Продолжайте сеять и культивировать органоиды, как описано в тексте рукописи. Диссоциированные одиночные клетки из передней доли были посеяны в ECM и выращены в органоидной среде гипофиза. Через 14 дней после посева органоиды были полностью развиты и достигли диаметра до 500 микрометров.
На этом этапе органоиды проявляли кистозную морфологию с эпителиальным слоем, охватывающим просвет. Не рекомендуется использовать колодцы, в которых после роста появляются плотные структуры. Для пассирования для посева использовались органоидные фрагменты.
Через семь дней после прохождения наблюдалось благоприятное восстановление органоидов при кистозных структурах. Плотные органоиды должны быть отброшены, так как неблагоприятные органоиды могут захватить культуру. Иммунофлуоресцентный анализ окрашивания на эпителиальные маркеры Е-кадгерин и цитокератины 8 и 18 подтвердили эпителиальный характер органоидов.
Экспрессия маркеров стволовых клеток гипофиза Sox2 и Trop2 продемонстрировала стволовость, а гипофизарно-специфический маркер LHX3 показал фенотип гипофиза органоидов. Экспрессия маркера Ki67 показала, что органоидно-конституирующие клетки находятся в пролиферативном состоянии. Анализ RTQ PCR показал более высокую экспрессию маркеров стволовости в органоидах, чем в передней доле, даже после нескольких проходов, подтверждая обогащение стволовых клеток.
Важно наметить соответствующее количество одиночных клеток в куполе ECM при первоначальном посеве, и при прохождении органоидов необходимо помнить о повторном засеве фрагментов, а не отдельных клеток.
