هذا البروتوكول مهم لأنه لا يوضح فقط نهج لتنقية الحويصلات من الثقافة على مستويات مختلفة ، والمفاضلات ، والاختلافات بين المنهجيات ، وكذلك النظر في العمل مع العينات الميدانية. تقدم البكتيريا الزرقاء تحديات فريدة لأخذ عينات الحويصلة وتحليلها. وقد نجحت هذه التقنيات في عزل وتركيز الحويصلات من الثقافة ومن العينات البيئية.
لتركيز عينات أقل من 500 ملليلتر، ابدأ بشطف مكثفات الطرد المركزي فائقة الترشيح التي يتراوح حجمها بين 15 و20 ملليلتر بمياه فائقة النقاء من النوع 1. قم بتحميل المكثفات في جهاز الطرد المركزي وقم بالدوران عند 4،400 × g عند أربع درجات مئوية. تجاهل التشغيل وكرر الخطوة مرتين على الأقل.
قم بتحميل العينة الفائقة في مكثف مغسول بالماء وقم بالدوران تحت نفس الظروف. كرر هذه الخطوة حتى تتركز العينة إلى حجم نهائي من 15 إلى 30 ملليلتر. لتركيز حجم يزيد عن 500 ملليلتر، قم بإجراء ترشيح التدفق العرضي عن طريق إعداد الجهاز كما هو موضح في المخطوطة.
قم بتوصيل مضخة تمعجية بخط السحب ووضع مشابك قابلة للتعديل على خط الثبات. قم بتعقيم ترشيح التدفق العرضي كما هو موضح في المخطوطة ، ثم اغسل الجهاز بلتر واحد من الماء فائق النقاء من النوع 1. أضف أقل من 0.2 ميكرون ترشيح إلى خزان العينة.
قم بزيادة سرعة المضخة ببطء ومستويات الضغط الخلفي على خط الارتداد لزيادة الإنتاج من خطوط الترشيح. استمر في تشغيل ترشيح التدفق العرضي وإعادة ملء الخزان بمادة الاستزراع الفائقة عند إزالة المادة. توقف عن تركيز العينة بمجرد وصول الحجم الموجود في الخزان إلى أدنى كمية ممكنة مطلوبة للحفاظ على التدفق إلى خط السحب دون إدخال فقاعات الهواء.
أغلق خط التدفق الخارجي بمشبك. قم بإزالة الضغط الخلفي على خط التوقف. أعد تدوير المادة الفائقة المركزة من خلال الفلتر لمدة 10 دقائق ، مما يقلل من معدل إعادة التدوير من 20 إلى 40 ملليلتر في الدقيقة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش.
انقل خط الارتداد إلى وعاء نظيف ، وقم بإزالة خط السحب من العينة وجمع المواد المركزة. استرجع أي مواد متبقية في خزان العينة باستخدام ماصة. قم بتصفية السوبرناتانت المركز من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون.
إذا لزم الأمر، قم بتخزين التركيز النهائي عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أسابيع تقريبا قبل الانتقال إلى تنقية الحويصلة. لتكوير عينة المستنبتة المركزة ضعها في أنبوب جهاز طرد مركزي نظيف وأضف وسائط نظيفة أو عازلا لضمان ملء الأنبوب. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant باستخدام ماصة.
أعد غسل المواد الحبيبية باستخدام وسائط استزراع جديدة أو غسل عازل ، مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X وكرر الطرد المركزي. أعد تعليق الكرية النهائية في الثقافة الطازجة عن طريق السحب اللطيف باستخدام ماصة ملليلتر واحدة ونقلها إلى وعاء نظيف. لإجراء الطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة، قم بإعداد مخزون اليوديكسانول كما هو موضح في المخطوطة.
امزج جزءا واحدا من المخزن المؤقت 4X مع ثلاثة أجزاء من مخزون اليوديكسانول بنسبة 60٪ لصنع محلول يوديكسانول بنسبة 45٪. تمييع 45٪ يوديكسانول مع المخزن المؤقت 1X لإنشاء مخزونات من الوسائط المتدرجة من تركيزات اليوديكسانول النهائية 40 و 35 و 30 و 25 و 20 و 15 و 10٪. بعد ذلك ، تراكب كميات متساوية بعناية من جميع مخزونات تدرج اليوديكسانول هذه في أنبوب طرد مركزي فائق ، باستخدام حجم الأنبوب بأكمله.
بعد الطرد المركزي ، اجمع كسور 0.5 ملليلتر لكل منها لتدرج 4.5 ملليلتر تقريبا عن طريق السحب بعناية أو استخدام جامع الكسور. أوجد كثافة كل كسر، بالجرام لكل ملليلتر، باستخدام ميزان تحليلي وماصة معايرة. قم بإزالة العينة من الأنبوب ، وحدد الوزن وأعد العينة إلى الأنبوب.
قم بتخفيف الكسور الفردية باستخدام مخزن مؤقت نظيف في أنبوب جديد متبوعا بوسائط نظيفة أو غسيل عازل. ضع بعناية خمسة ميكرولترات من الحويصلة واتركها لمدة خمس دقائق. قم بإزالة العينة عن طريق لمس حافة الشبكة بقطعة من ورق الترشيح النظيف.
ماصة من 20 إلى 50 ميكرولتر من خلات اليورانيل 2٪ على سطح مستو مغطى بفيلم بلاستيكي. ثم ضع الشبكة العائمة فوقها لمدة دقيقتين. أزل أسيتات اليورانيل باستخدام ورق الترشيح وطفو لفترة وجيزة على قطرة من الماء فائق النقاء لغسلها.
املأ الغرفة بالماء فائق النقاء باستخدام حقنة نظيفة وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء. انقر فوق كاميرا بدء التشغيل وتصور المنطقة المثلى للغرفة حول بصمة الإبهام. حرك أشرطة تمرير كسب الشاشة ومستوى الكاميرا نحو الحد الأقصى، ثم قم بخفضها إلى أدنى مستوى لرؤية الجسيمات الأكثر تعتيما.
اضبط التركيز البؤري حسب الضرورة لضمان أن تكون الجسيمات مرئية بالتساوي تقريبا عبر مجال الرؤية واستمر في الغسيل بالماء النظيف للغاية حتى تصبح الغرفة نظيفة. أضف عينة الحويصلة إلى الغرفة باستخدام حقنة ملليلتر واحدة وتأكد من إعدادات الاكتساب. حدد القياس القياسي' من المربع المنسدل SOP وقم بتغيير الإعدادات لجمع ما لا يقل عن ثلاثة نسخ طبق الأصل تقني من مقاطع الفيديو التي تبلغ مدة كل منها 60 ثانية.
اضغط على إنشاء "وتشغيل البرنامج النصي" واتبع المطالبات وادفع ما يقرب من 100 ميكرولتر من العينة إلى الغرفة بين النسخ المتماثلة. حدد معلمات الجسيمات بالنقر فوق "وفتح التجربة" وتحميل ملف العينة. حدد معالجة الملفات المحددة' وانتظر حتى يكتمل التحليل.
أظهر عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية من البكتيريا الزرقاء Synechocystis sp. PCC6803 ، أن الغشاء الخارجي يحتوي على الكاروتينات ، والتي تمنح تلوينا برتقاليا مميزا لعينات الحويصلة التي تم جمعها عن طريق التكوير المباشر من خلال الطرد المركزي الفائق. تم فحص حبيبات الحويصلة المعاد تعليقها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل إما عن طريق تلطيخ العينات سلبا بخلات اليورانيل أو عن طريق مراقبة أقسام رقيقة للغاية.
تم تقييم توزيع حجم الحويصلة وتركيزها باستخدام تحليلات تشتت الضوء الديناميكي وتتبع الجسيمات النانوية. تم فصل حويصلات Synechocystis sp. PCC6803 المنقاة على هلام كبريتات الصوديوم دوديسيل بولي أكريلاميد وملطخة بالسكريات الدهنية.
يجب أخذ العينات قبل وبعد عينة الحويصلة المركزة للتأكد من أن ترشيح التدفق العرضي يعمل وأن الحويصلات تتركز. ثم تحتاج إلى قياس كلتا العينتين باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية. ويلزم بذل جهود في المستقبل لدمج هذه الطريقة مع نهج أخرى مثل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو تجزئة تدفق المجال غير المتماثل لتحسين التمييز والعزل للجسيمات الصغيرة عن العينات المستزرعة والبيئية.
هذه التقنية مفيدة لدراسة حويصلات البكتيريا الزرقاء والأدوار الوظيفية المحددة لهذه الحويصلات في بيولوجيا البكتيريا الزرقاء.
