إنه بروتوكول بسيط وسريع يسمح للأشخاص الذين ليسوا على دراية بالبكتيريا الزرقاء بعزل الفيكوبيليسوم بسهولة. ميزة هذه التقنية هي أنها تتكيف مع نطاق صغير ومن السهل تنفيذها. إنها طريقة بسيطة وموثوقة وفعالة لعزل الفيكوبيليزومات السليمة للبكتيريا الخلوية النموذجية وغير النموذجية.
ابدأ بنقل ثقافة الخلية البالغة 0.8 OD عند 750 نانومتر إلى قارورة لتر واحد وقم بتخفيفها في 500 ملليلتر من وسط B-HEPES لتحقيق OD البالغ 0.2 عند 750 نانومتر. قم بزراعة الثقافة مع التحريك المستمر عند 30 درجة مئوية حتى يصل OD إلى 0.8 إلى 1 ، مما يشير إلى مرحلة نمو أسية متأخرة. جهاز الطرد المركزي للثقافة بسرعة 10،000 مرة غرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant.
تعليق الكريات الخلوية وغسلها مرتين مع 0.75 مولار فوسفات البوتاسيوم العازلة، ودرجة الحموضة سبعة. بيليه الخلايا في أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر عن طريق التركيز في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا باستخدام 0.75 وحدة تخزين مؤقتة لفوسفات البوتاسيوم المولي.
قم بقياس الوزن الرطب للحبيبة بواسطة ميزان إلكتروني وأعد تعليق الوزن الرطب للجرام الواحد للحبيبة في خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت. أضف ملليلتر واحد من تعليق الخلية و 0.4 إلى 0.6 جرام من الخرز الزجاجي 0.1 ملليمتر في قارورة غطاء لولبية بمقدار مليلترين. كسر الخلايا لمدة 30 ثانية بواسطة مضرب حبة.
اترك الأنابيب لتبرد في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد التحلل ، قم بطرد القوارير لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة بسرعة 500 مرة جم. جمع supernatant مع ماصة في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر.
اغسل الخرز ب 0.5 ملليلتر من 0.75 مولي من فوسفات البوتاسيوم العازل مرة واحدة ، ثم نقلها إلى نفس أنبوب الطرد المركزي. أضف Triton X-100 إلى نظام تعليق الخلايا المحللة واحتضنه على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة و 40 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة أو حتى يصبح المحلول متجانسا. قم بطرد الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 17،210 مرات غرام وتخزين supernatant بدون طبقة الميسيل Triton العليا في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ساعة واحدة.
اصنع أربعة تركيزات من السكروز في 0.75 مولي من فوسفات البوتاسيوم العازل عند درجة الحموضة السابعة. ضع 2.8 ملليلتر من اثنين من عازلة السكروز المولية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي سعة 40 ملليلتر وتراكب مع ثلاث طبقات من محاليل السكروز. أخيرا ، أضف ثلاثة ملليلترات من PBS تحتوي على الكسر الفائق وطرد التدرجات الناتجة.
عند التمركز الفائق ، قم بتكثيف PBS المجزأة والبروتينات الفيزيائية بين الطبقات ولاحظ النطاقات الزرقاء في Syn6803 والواجهات. قم بإزالة السكروز عن طريق التركيز المتكرر وتخفيف الكسور باستخدام 0.75 مولي من فوسفات البوتاسيوم العازل وغشاء وحدات مرشح الطرد المركزي. لقياس التألق PBS ، قم بتخفيف عينة PBS المركزة باستخدام 0.75 مخزن مؤقت لفوسفات البوتاسيوم المولي لتكوين حجم يصل إلى 500 ميكرولتر.
أضف عينة PBS المخففة إلى أنبوب زجاجي شفاف وقم بتجميد الأنبوب في النيتروجين السائل حتى يتم تجميده بالكامل. حرك الأنبوب المجمد إلى حاوية ديوار شفافة مملوءة مسبقا بالنيتروجين السائل. يظهر التحلل الكامل للخلايا اللون الأزرق والأخضر الداكن قبل التركيز.
يظهر الفصل المتدرج لكثافة السكروز ل PBS المعزول عدة أجزاء من البروتينات الفيزيائية المنفصلة ويمثل الكسر الأدنى PBS السليم. أطياف الامتصاص من PBS المنفصلة والسليمة ل JSC one و Syn6803 لها نفس الذروة عند 622 نانومتر ، المقابلة للفيكوسيانين. علاوة على ذلك ، يبلغ امتصاص الفيكوريثرين ذروته عند 571 نانومتر في كل من PBS المنفصلة والسليمة من JSC-1.
أطياف الانبعاثات من PBS المنفصلة لها ذروة قوية واحدة عند حوالي 650 نانومتر في Syn6803 و JSC-1 ، مما يمثل الانبعاثات من الفيكوسيانين. تكشف القمم القصوى للانبعاثات الفلورية عند 651 نانومتر و 684 نانومتر أن الطاقة التي يتم حصادها بواسطة الفيكوسيانين تم نقلها بكفاءة إلى الباعثات الالوفيكوسيانين والبواعث الطرفية ، وهي ApcD و ApcE ، في القلب. يوضح الشكل SDS-PAGE الملطخ بالزنك تحت الأشعة فوق البنفسجية حيث تكون الوحدات الفرعية للبروتين الفيزيائي متألقة بقوة وأظهر ApcE تألقا ضعيفا ، يشار إليه بالسهم.
يظهر تلطيخ كوماسي الأزرق أن الكسور العليا تحتوي على بروتينات أخرى غير PBS قابلة للذوبان في الماء وأن PBS و Syn6803 سليمين يظهران نطاقا بارزا من ApcE ، يشار إليه بسهم ، يفتقر إلى كسور PBS المنفصلة. يوضح الطرد المركزي الفائق أن تدرج السكروز المحضر بنسبة 1:3 يعرض نطاقات أوسع من التدرج الذي تم إجراؤه بنسبة 1:10. من المهم تحلل الخلايا وتحلل المذيبات تماما للحصول على المزيد من الفيكوبيليزومات.
يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل cryo-EM أو قياس الطيف المختلط ، لدراسة بنية البروتين أو تكوين البروتين من phycobilisomes.
