このプロトコルは、異なるスケールで培養物から小胞を精製するためのアプローチ、トレードオフ、方法論の違い、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項を示すだけでなく、重要である。シアノバクテリアは、ユニークな小胞サンプリングと分析の課題を提示します。これらの技術は、培養物および環境サンプルから小胞を単離および濃縮することに成功している。
500ミリリットル未満のサンプルを濃縮するには、15〜20ミリリットルの限外ろ過遠心濃縮器をタイプ1超純水ですすぐことから始めます。濃縮器を遠心分離機に装填し、摂氏4度で4,400 x gで回転させます。実行を破棄し、この手順を少なくとも 2 回繰り返します。
上澄みサンプルを水すすぎ濃縮器にロードし、同じ条件でスピンする。サンプルが15〜30ミリリットルの最終容量まで濃縮されるまで、この手順を繰り返します。500ミリリットル以上の体積を濃縮するには、原稿に記載した装置を設置して接線流ろ過を行う。
ペリスタルティックポンプを吸気ラインに取り付け、保持ラインに調整可能なクランプを置きます。原稿に記載されているように接線流ろ過を消毒し、1リットルのタイプ1超純水で装置を洗い流します。0.2ミクロン未満の濾液をサンプルリザーバに加える。
保持液ラインのポンプ速度と背圧レベルをゆっくりと上げて、濾液ラインからの出力を増やします。引き続き接線流ろ過を実行し、材料が除去されたら培養上清をリザーバに補充します。リザーバ内の体積が気泡を導入せずに吸気ラインへの流れを維持するために必要な最小量に達したら、サンプルの濃縮を停止します。
流出ラインをクランプで閉じます。保持液ラインの背圧を取り除きます。濃縮された上清をフィルターを通して10分間再循環させ、再循環速度を毎分20ミリリットルから40ミリリットルに減少させて回収率を最大化します。
保持液ラインを清潔な容器に移動し、サンプルから吸気ラインを取り外し、濃縮材料を回収する。ピペットを使用してサンプルリザーバに残っている材料を回収します。濃縮された上清を0.2ミクロンのシリンジフィルターでろ過します。
必要に応じて、最終濃縮物を摂氏4度で約3週間保存してから、小胞精製に移行します。濃縮培養サンプルをペレット化するには、それをきれいな超遠心チューブに入れ、クリーンな培地またはバッファーを追加してチューブが満たされていることを確認します。遠心分離後、上清をピペットで取り除く。
ペレット状の材料を新鮮な培養培地または1Xリン酸緩衝生理食塩水などの洗浄緩衝液で再洗浄し、遠心分離を繰り返す。1ミリリットルのピペットで穏やかにピペッティングすることによって、最終ペレットを新鮮な培養物に再懸濁し、それをきれいな容器に移す。密度勾配超遠心分離を行うには、原稿に記載されているようにヨウジキサノールストックを調製する。
4X緩衝液の1部を60%ヨージキサノールストックの3部と混合して、45%ヨウジキサノール溶液を作る。45%イオジキサノールを1Xバッファーで希釈して、40、35、30、25、20、15および10%の最終イオジキサノール濃度のグラジエント培地のストックを作成します。次いで、これら全てのイオジキサノール勾配ストックの等量を超遠心管に注意深く重ね合わせ、管全体の容積を利用する。
遠心分離後、慎重にピペッティングするか、フラクションコレクターを使用して、それぞれ0.5ミリリットルの画分を約4.5ミリリットルの勾配で収集します。各フラクションの密度を、ミリリットルあたりのグラム数で、分析天秤および較正ピペットを使用して決定する。チューブからサンプルを取り出し、重量を決定し、サンプルをチューブに戻します。
個々の画分を新しいチューブ内のクリーンなバッファーで希釈し、その後、クリーンな培地またはバッファー洗浄を行います。5マイクロリットルの小胞を慎重に塗布し、5分間放置する。グリッドの端をきれいなろ紙に触れてサンプルを取り出します。
20~50マイクロリットルの酢酸ウラニルをプラスチックフィルムで覆われた平らな面にピペットで取り出します。次に、その上に浮かぶグリッドを2分間置きます。ろ紙を使って酢酸ウラニルを取り除き、超純水一滴に短時間浮かべて洗浄します。
清潔なシリンジを使用してチャンバーを超純水で満たし、気泡がないことを確認します。スタートカメラをクリックし、拇印の周りのチャンバーの最適な領域を視覚化します。画面ゲインとカメラレベルのスライダを最大に向かってスライドさせ、次に最も低いレベルまで下げて、最も暗いパーティクルを表示します。
必要に応じてフォーカスを調整して、粒子が視野全体でほぼ均等に見えるようにし、チャンバーがきれいになるまで超きれいな水で洗浄を続けます。1ミリリットルのシリンジを用いて小胞サンプルをチャンバーに加え、取得設定を確認する。[SOP]ドロップダウンボックスから[標準測定]を選択し、設定を変更して、それぞれ60秒のビデオの少なくとも3つの技術複製を収集します。
「作成」を押してスクリプトを実行し、プロンプトに従って、複製の間に約 100 マイクロリットルのサンプルをチャンバーに押し込みます。「分析」をクリックして粒子パラメータを決定し、実験を開き、サンプルファイルをロードします。選択したファイルを処理」を選択し、分析が完了するのを待ちます。
シアノバクテリウム・シネコシスチス属PCC6803からの細胞外小胞の単離および特性評価は、外膜がカロチノイドを含み、超遠心による直接ペレット化によって収集された小胞サンプルに特徴的なオレンジ色の着色を与えることを示した。再懸濁された小胞ペレットを、サンプルを酢酸ウラニルで陰性染色するか、または超薄切片を観察することによって、透過型電子顕微鏡によって検査した。
ベシクルのサイズ分布および濃度は、動的光散乱およびナノ粒子追跡分析を用いて評価した。精製されたSynechocystis sp. PCC6803小胞をドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル上で分離し、リポ多糖について染色した。
サンプルは、接線流ろ過が機能し、ベシクルが濃縮されていることを確認するために、濃縮ベシクルサンプルの前後に採取する必要があります。次に、ナノ粒子追跡分析を使用して両方のサンプルを測定する必要があります。この方法をサイズ排除クロマトグラフィーや不斉フィールドフロー分画などの他のアプローチと融合させ、培養サンプルや環境サンプルからの小粒子の識別と単離を改善するための将来の努力が必要です。
この技術は、シアノバクテリアの小胞と、シアノバクテリアの生物学におけるこれらの小胞の特定の機能的役割を研究するのに役立ちます。
