هذا البروتوكول مهم لأنه يظهر حلقات كروموسوم عالية الدقة وميزات تفاعل أخرى قصيرة المدى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي رسم خرائط لتنظيم الجينوم 3D بدقة نيوكليوسوم مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. لإجراء معايرة MNase ، قم بإذابة حبة واحدة من مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السادسة على الجليد لمدة 10 دقائق ، وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من DPBS ، واحتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 20 دقيقة.
جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 10،000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف. أعد تعليق الخلايا المحببة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MB رقم واحد. قم بإذابة قارورة واحدة من 20 وحدة لكل ميكرولتر MNase ، وقم بتخفيفها باستخدام 10 مليمولار Tris لظروف الهضم كما هو موضح في النص.
مع فترات زمنية مناسبة من 10 إلى 20 ثانية ، أضف ميكرولترا واحدا من محلول الهضم MNase الأول إلى أحد أنابيب العينات الأربعة ، الدوامة واحتضانها في خلاط حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق عند 800 دورة في الدقيقة. استمر في إضافة ميكرولتر واحد من تخفيفات MNase المتبقية إلى حصص الخلايا الأخرى. أوقف هضم MNase عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحضر حديثا إلى كل أنبوب بنفس الترتيب ونفس الفترة الزمنية التي تمت فيها إضافة MNase.
احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة ساعتين. أضف 500 ميكرولتر من PCI إلى كل عينة ، واخلطها جيدا عن طريق الدوامة. أجهزة الطرد المركزي في 19،800 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل المراحل.
ونقل المرحلة المائية إلى أنابيب جديدة. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، وقم بإزالة العينات في 12 ميكرولتر من محلول الشطف. أضف اثنين إلى خمسة ميكرولتر من صبغة التحميل إلى عينة الحمض النووي المنقاة.
قم بتشغيل العينات على هلام أغاروز 1.5٪ ، واختر أفضل درجة من الهضم للتجربة. تظهر درجة الهضم المثلى شظايا تحت النواة قليلة أو معدومة ، ونسبة 70 إلى 90٪ أحادية إلى ثنائية النوكليوسوم. في هذه العينة التمثيلية ، تم اختيار درجة هضم متوسطة بين الحارتين الثالثة والرابعة لتجارب المتابعة.
بناء على معايرة MNase ، قم بهضم الكروماتين عن طريق إضافة الكمية المناسبة من MNase إلى كل عينة من القسامة. تخلط جيدا وتحتضن في ThermoMixer عند 37 درجة مئوية ، 800 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. أوقف هضم MNase بإضافة 1.6 ميكرولتر من 0.5 مولار EGTA إلى كل قسمة ، واحتضانها في خلاط حراري عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع اهتزاز 800 دورة في الدقيقة.
اجمع العينة عن طريق الطرد المركزي عند 10،000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من 1X NEB buffer 2.1. تجميع العينات المكافئة لمدخلات خمسة في 10 إلى الخلايا السادسة أو أقل لمزيد من المعالجة.
قبل الشروع في ربط القرب ، انقل 10٪ من العينة كعنصر تحكم في الإدخال لمراقبة مستوى هضم MNase. أضف 150 ميكرولترا من 10 ملليمولار تريس ، و 25 ميكرولترا من 10٪ SDS ، و 25 ميكرولترا من 20 ملليغرام لكل ملليلتر بروتيناز K إلى التحكم في الهضم ، واحتضان بين عشية وضحاها عند 65 درجة مئوية. اجمع العينة المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 10،000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق الحبيبات في 90 ميكرولترا من مزيج Micro-C الرئيسي المحضر حديثا ، واحتضانه في خلاط حراري عند 37 درجة مئوية ، 800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. أضف 10 ميكرولتر من خمس وحدات لكل ميكرولتر جزء من Klenow واحتضانه في خلاط حراري. ثم أضف 100 ميكرولتر من مزيج Micro-C الرئيسي الطازج اثنين.
احتضان لمدة 45 دقيقة عند 25 درجة مئوية ، 800 دورة في الدقيقة ، وإخماد التفاعل الأنزيمي مع EDTA كما هو موضح في النص. احتضان في خلاط حراري لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، 800 دورة في الدقيقة. اجمع العينة عن طريق الطرد المركزي عند 10،000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية.
أعد تعليق العينة في 500 ميكرولتر من المزيج الرئيسي Micro-C الطازج ثلاثة ، واحتضانها لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة عند 15 إلى 20 دورة في الدقيقة. كرر الطرد المركزي وإزالة الطاف. ثم أعد تعليق العينة في 200 ميكرولتر من المزيج الرئيسي Micro-C المحضر حديثا أربعة ، واحتضانها في خلاط حراري مضبوط على 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة عند 800 دورة في الدقيقة.
للربط المتقاطع العكسي وإزالة البروتين ، أضف 25 ميكرولترا من 20 ملليغرام لكل ميكرولتر بروتيناز K و 25 ميكرولتر من 10٪ SDS إلى العينة ، واحتضانها عند 65 درجة مئوية طوال الليل مع الخلط المتقطع. أضف 500 ميكرولتر من PCI إلى العينات والتحكم في الإدخال ، ثم اخلطها عن طريق الدوامة. افصل المراحل عن طريق الطرد المركزي عند 19،800 جم لمدة خمس دقائق ، وانقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد.
تركيز الحمض النووي واستخلاص العينات في 30 ميكرولتر ، وضوابط الإدخال في 15 ميكرولتر. قم بتشغيل جل أغاروز 1.5٪ لفصل أحاديات النوكليوسومات وثنائي النوكليوسومات. استئصال شظايا الحمض النووي التي لها حجم ثنائي النواة ، واستخرج الحمض النووي كما هو موضح في النص.
أضف 150 ميكرولترا من الخرز المعد مسبقا إلى 150 ميكرولتر من العينة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب في مغناطيس مناسب وانتظر حتى يزول المحلول. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخرز في 300 ميكرولتر من 1X TBW ، وكرر هذه الخطوة.
كرر الفصل المغناطيسي ، وبعد مسح المحلول ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من 0.1X TE. كرر وأعد التعليق في 50 ميكرولتر من 0.1X TE. نقل الحل إلى أنابيب PCR وإجراء التلاعب الحمض النووي كما هو موضح في النص. بعد اكتمال ربط المحول ، اغسل العينة في 1X TBW ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخرز في 20 ميكرولترا من 0.1X TE. قم بتحسين عدد دورات PCR وتضخيم مكتبات التسلسل كما هو موضح في النص. تم هضم الكروماتين من 250،000 خلية لكل تفاعل مع تخفيف أربعة أضعاف من MNase.
أظهر أعلى تركيز ، 10 وحدات ، كروماتين مفرط الهضم يتكون بشكل حصري تقريبا من الحمض النووي أحادي النواة. قدم هضم 250،000 خلية ES فأر مع 0.625 وحدة من MNase نقطة البداية الواعدة لعمليات الهضم التحضيرية في تجارب Micro-C. ومع ذلك ، ينبغي النظر في تركيز MNase الوسيط بين الظروف الموضحة في الممرات الثالثة والرابعة ، المقابلة لخمس وحدات لكل 1 مليون خلية.
كان لنطاق أحادي النوكليوسوم المرتبط بالقرب حجم تقريبي يبلغ 300 زوج من القواعد ، على غرار ثنائي النوكليوسومات. لذلك ، تحولت نسبة إشارة النطاق الأحادي إلى ثنائي النوكليوسومات من النوكليوسومات أحادية النوكليوسومات في الغالب إلى ثنائي النوكليوسومات. تم تقييم جودة وكمية مكتبة التسلسل المعدة عبر الحد الأدنى من تفاعل البوليميراز المتسلسل.
أظهر التصور نطاقا متميزا واحدا عند 420 زوجا أساسيا ، ولا توجد نطاقات لثنائيات المحول. بينما أظهرت كلتا العينتين في هذه الدراسة معدلات خرائط عالية ، كان للعينة الجيدة جزء أعلى من قراءات رابطة الدول المستقلة. يشير ارتفاع معدل التداخلات عبر الكروموسومات إلى أحداث ربط عشوائية، على الرغم من أن بعض التداخلات عبر الكروموسومات قد تكون مهمة.
بالإضافة إلى ذلك ، كان للعينة الجيدة معدل معتدل من أزواج قراءة الخرائط الأمامية والعكسية ، مع مسافات أقل من 500 زوج أساسي. يشير هذا إلى انخفاض معدل ثنائي النوكليوسومات غير المشقوق بواسطة MNase الذي له حجم مماثل لاثنين من النيوكليوسومات المربوطة بالقرب. تعد درجة هضم MNase المناسبة أمرا بالغ الأهمية لهذه التجربة.
يتم ربط النيوكليوسومات شديدة الهضم بشكل غير فعال ، ويحتوي الكروماتين غير المهضوم على جزء كبير من ثنائيات النوكليوسومات غير المهضومة التي يمكن أن تلوث مكتبة التسلسل. يمكن دمج Micro-C مع نهج الالتقاط لرسم خريطة لتنظيم الجينوم الخاص بالموقع بدقة عالية للغاية.
