وقد ثبت أن ديناميكيات الكروماتين العالمية هي وسيط مهم للعديد من الحالات المرضية، مثل السرطان والشيخوخة. يوفر بروتوكولنا نموذجا ذا صلة فسيولوجية لدراسة هذه العملية. عادة ما يقتصر التحليل المختبري القياسي لتعديلات ما بعد الترجمة من هيستون أو PTMS على فحص PTM واحد في كل مرة باستخدام الفحوصات القائمة على الأجسام المضادة.
يسمح لنا تحليل الطيف الكتلي الكروماتوغرافي السائل ل histone PTMS بقياس وفرة مئات PTMS في تجربة واحدة. وسيشارك في هذا الإجراء كل من ستيفاني سترانسكي ورونالد كاتلر وجولي كيم، وهي طالبة دراسات عليا في مرحلة ما بعد الدكتوراه وتكنولوجيا البحوث، على التوالي، من المختبر. أولا ، باستخدام وسائط النمو القياسية ، تنمو الخلايا كطبقة أحادية حتى تلتقي بنسبة 80٪.
ثم اغسل الخلايا باستخدام HBSS. أضف خمسة ملليلترات من 0.05٪ من التربسين-EDTA المخفف في HBSS. احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
استخدم المجهر للتحقق من انفصال الخلايا. بعد حساب الخلايا ، قم بتخفيف تعليق الخلية باستخدام وسائط نمو جديدة. أضف 0.5 ملليلتر من وسائط النمو لتحقيق التوازن بين صفيحة سفلية مستديرة منخفضة للغاية من 24 بئرا مع العديد من الآبار الدقيقة في كل منها.
ثم الطرد المركزي للألواح عند 3000 × g لإزالة فقاعات الهواء من سطح اللوحة. الآن انقل نظام التعليق الخلوي المصنوع مسبقا إلى لوحة 24 بئرا وأجهزة الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 120 × جم. تحقق من الخلايا الموجودة في الصفيحة المكونة من 24 بئرا ثم احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة لتشكيل كروي.
وفي الوقت نفسه ، لتحقيق التوازن بين المفاعل الحيوي ، أضف 25 ملليلتر من الماء المعقم إلى غرفة الرطوبة وتسعة ملليلتر من وسائط النمو إلى غرفة الخلية. احتضان المفاعل الحيوي في حاضنة clinostat دوارة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. افصل الكرويات عن طبق 24 بئرا منخفض للغاية عن طريق السحب بلطف باستخدام أطراف تجويف واحدة عريضة ملليلتر ، وانقلها إلى طبق زراعة الأنسجة.
لاختيار أشكال كروية بما فيه الكفاية ، تحقق من جودة الكرويات تحت المجهر. الكرويات ذات النوعية الجيدة لها حجم موحد ، والاكتناز ، والاستدارة. املأ المفاعل الحيوي المتوازن بخمسة ملليلترات من وسائط النمو الطازجة ، وانقل الكرويات إليه.
ثم املأ المفاعل الحيوي بالكامل بوسائط نمو جديدة وضع المفاعل الحيوي في حاضنة clinostat عند 10 إلى 11 دورة في الدقيقة. كل يومين إلى ثلاثة أيام ، تبادل وسائط النمو عن طريق استبدال 10 ملليلتر من الوسائط القديمة بوسائط جديدة. مع زيادة حجم هذه الكروية وعددها ، قم بزيادة سرعة دوران الحاضنة.
بعد الحصول على الكريات الكروية ، أضف خمسة مجلدات من حمض الكبريتيك المولي البارد 0.2 إلى الكريات وماصة لأعلى ولأسفل لتعطيل الكريات وإطلاق الهيستونات. بمجرد الحصول على المادة الفائقة بعد الطرد المركزي ، أضف حمض ثلاثي كلورو أسيتيك المركز البارد ، بحيث يصبح التركيز النهائي 25 إلى 30٪ من الحجم من حيث الحجم. ومزجها عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح في المخطوطة.
بعد التخلص من السوبرناتانت ، باستخدام ماصة مراعي زجاجية ، اغسل الكريات وجدران الأنبوب بحوالي 500 ميكرولتر من الأسيتون البارد و 0.1٪ من حمض الهيدروكلوريك ، ثم جهاز طرد مركزي عند 3،400 × غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم اقلب الأنبوب للتخلص من السوبرناتانت. باستخدام ماصة المراعي الزجاجية ، أضف 500 ميكرولتر من الأسيتون البارد بنسبة 100٪ لغسل الكريات وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا.
بعد التخلص من السوبرناتانت ، قم بإزالة الأسيتون تماما عن طريق السحب بعناية ، واترك العينة تجف بغطاء مفتوح لمدة 20 دقيقة تقريبا. أعد تعليق الكريات في 20 ميكرولتر من 15 إلى 20٪ من الأسيتونيتريل في بيكربونات الأمونيوم 100 مللي مول من الرقم الهيدروجيني 8. بعد الدوامة ، قم بتدوير التعليق عند 1000 × g لمدة 30 ثانية.
بالنسبة لثماني عينات أو أكثر، انقل كل عينة معلقة إلى صفيحة من 96 بئرا. ثم ، في غطاء محرك السيارة ، أضف ميكرولترين من أنهيدريد البروبيونيك واخلطه عن طريق السحب خمس مرات. أضف بسرعة 10 ميكرولترات من هيدروكسيد الأمونيوم واخلطها عن طريق السحب خمس مرات.
امزج راتنج HLB على لوحة تحريك مغناطيسية. ثم أضف 70 ميكرولتر من نظام تعليق HLB إلى كل بئر من لوحة مرشح 96 بئرا على لوحة تجميع 96 بئرا. بعد التخلص من التدفق ، اغسل الراتنج ب 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪.
بعد تعليق كل عينة في 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪ ، قم بتحميل كل عينة في كل بئر ومنع الرش باستخدام فراغ. بعد التخلص من التدفق ، اغسل العينات ب 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪ ، وضع لوحة المرشح على لوحة تجميع جديدة. بعد ذلك ، أضف 60 ميكرولتر من 60٪ من الأسيتونيتريل في 0.1٪ من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك إلى كل بئر ومنع الرش باستخدام الفراغ.
جمع التدفق من خلال وتجفيفها في فراغ السرعة. قم بتحميل لوحة التجميع المجففة في HPLC وقم بتشغيل طريقة LC / MS / MS كما هو موضح في المخطوطة. في هذه الدراسة ، لوحظت الوفرة النسبية لتعديلات الهيستون الشائعة بعد الترجمة في خلايا الكبد C3A المزروعة كروية ثلاثية الأبعاد.
يمكن أيضا ملاحظة تعديلات ما بعد الترجمة على بقايا واحدة في الببتيدات المتولدة من بروتينات الهيستون. زادت معالجة الكرويات ببوتيرات الصوديوم من الوفرة النسبية لأسيتيلات الهيستون ، في حين أن ذلك مع سكسينات الصوديوم عزز سكسينيلات بقايا الهيستون. أظهرت الطريقة أيضا نمط توزيع أسيتيلات الهيستون بعد معالجة بوتيرات الصوديوم ونمط سكسينيلات الهيستون بعد العلاج بسكسينات الصوديوم.
أظهرت النتيجة أيضا أنماطا شائعة لتعديلات هيستون مختلفة. عززت معالجات بوتيرات الصوديوم بشكل كبير من أسيتيلات بقايا الليسين 14 على الببتيد المتولد من بروتين الهيستون H3 ، فقط عندما كانت بقايا الليسين التاسعة تحتوي على مجموعتين من الميثيل ، ولكن ليس مجموعة واحدة أو ثلاث مجموعات ميثيل. كما تم حساب الوفرة النسبية للتعديلات الفردية ومجموعات مختلفة من التعديلات اللاحقة للترجمة في الببتيد المشتق من H3.
كما لوحظت أنماط توافقية من التعديلات اللاحقة للترجمة بعد معالجة بوتيرات الصوديوم في الببتيد المتولد من بروتين الهيستون H4. هنا أيضا ، أدى علاج بوتيرات الصوديوم إلى زيادة كبيرة في الأسيتيلات. يجب إيلاء اهتمام حاسم للحفاظ على الكرويات على مقاعد البدلاء بأقل قدر ممكن وفي خطوة تحلية لتجنب انسكاب العينات. يمكن استخدام سير العمل هذا لاستكشاف الكروماتين في الأنسجة الصلبة باستخدام نموذج فسيولوجي أكثر من التكرار السريع لمزارع الخلايا المسطحة.
