يفصل هذا البروتوكول جميع الإجراءات التجريبية ، من وضع علامات على جينات ترميز عامل النسخ من خلال تحليل البيانات الحسابية ، لإجراء التنميط على مستوى الجينوم لتفاعلات ربط عامل النسخ والحمض النووي في المبيضات البيضاء عبر CUT & RUN. هذه تقنية أكثر سهولة وأسرع وأكثر حساسية وأقل تكلفة ، وتوفر بيانات عالية الجودة من النهج التقليدية لرقاقة ChIP و ChIP-seq. على الرغم من أن بروتوكولنا تم تطويره لخلايا المبيضات البيضاء المعزولة من الأغشية الحيوية أو ثقافات العوالق ، إلا أنه يجب أن يكون من العملي تكييفه مع أي شكل جيد من خلايا المبيضات البيضاء.
بعد احتضان تعليق الخلية ، انقل أليكوت خمسة ميكرولتر إلى أنبوب PCR جديد. إلى خمسة ميكرولترات من النوى المعزولة وخمسة ميكرولتر من الخلايا السليمة المخزنة سابقا عند أربع درجات مئوية ، أضف ميكرولتر واحد لكل من Calcofluor-white و SYTO 13. تحضن عند 30 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.
فحص بصري لسلامة ونقاء النوى المعزولة باستخدام المجهر الفلوري. ابحث عن النوى المعزولة التي تظهر تلطيخا بارزا ل SYTO 13 وتأكد من عدم تلطيخ جدار الخلية بواسطة صبغة الكالكوفلور البيضاء. كرر الفحص باستخدام خلايا سليمة كعنصر تحكم في تلطيخ جدار الخلية بصبغة كالكوفلور البيضاء.
ضع الأنابيب على رف مغناطيسي وانتظر حتى يصبح الملاط واضحا تماما. تخلص من السوبرناتانت باستخدام ماصة. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للأجسام المضادة واخلطها بلطف عن طريق السحب.
أضف ثلاثة ميكرولترات من الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد ل GFP إلى الأنابيب واحتضن الأنابيب على خلاط مغذي عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين. قم بطرد الأنابيب لفترة وجيزة عند 100 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ثوان وضع الأنابيب على رف مغناطيسي. بمجرد أن يصبح الملاط صافيا ، تخلص من supernatant باستخدام ماصة.
في حين أن الأنابيب مع الخرز لا تزال على الرف المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة مباشرة على الخرز. تخلص من السوبرناتانت باستخدام ماصة. كرر غسلتين باستخدام المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة الثلجية.
أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة إلى كل أنبوب واخلطها بلطف عن طريق السحب. أضف 2.5 ميكرولتر من بروتين AG-MNase إلى كل عينة واخلطها عن طريق السحب. ضع العينات على خلاط المغذيات عند 4 درجات مئوية واحتضن العينات لمدة ساعة واحدة.
قم بطرد الأنابيب الشريطية لفترة وجيزة عند 100 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ثوان ، ثم ضع الأنابيب على رف مغناطيسي. بمجرد أن يصبح الملاط صافيا ، تخلص من supernatant باستخدام ماصة. في حين أن الأنابيب مع الخرز لا تزال على الرف المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة مباشرة على الخرز.
تخلص من السوبرناتانت باستخدام ماصة. كرر غسلتين باستخدام المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة الثلجية. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الخلايا الباردة إلى العينات وقم بسحبها بلطف لأعلى ولأسفل خمس مرات.
قم بإزالة الجل المصبوب من صندوق الجل وافتح قالب الجل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإزالة الجل بلطف من قالب الجل وضعه داخل صينية تحمل الجل تحتوي على 100 ملليلتر من TBE أحادي القوة. أضف 10 ميكرولترات من بقعة هلام الحمض النووي إلى الدرج وقم بالتدوير بلطف.
يغطى بورق القصدير للحماية من الضوء ويحضن بشكل ثابت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم شطف الجل مرتين مع 100 ملليلتر من ماء الصنبور منزوع الأيونات. صور الجل تحت إضاءة الضوء الأزرق باستخدام غطاء مرشح كهرماني.
لكل مكتبة، اقطع الجل أعلى قليلا من شريط المحول البارز المكون من 125 زوجا أساسيا تقريبا وأسفل علامة سلم الزوج الأساسي 400. ثقب الجزء السفلي من أنبوب 0.65 ملليلتر باستخدام إبرة قياس 22 ووضع الأنبوب المثقوب داخل أنبوب ميكروفوجي معقم سعة مليلترين. انقل شريحة الجل إلى الأنبوب المثقوب داخل أنبوب microfuge سعة مليلترين.
قم بطرد مركزي لأنبوب الطرد الدقيق سعة مليلتر الذي يحتوي على الأنبوب المثقوب بسعة 0.65 ملليلتر والعينة عند 10000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين لجمع ملاط الجل داخل أنبوب الطرد الدقيق سعة مليلترين. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للجل البارد المثلج إلى ملاط الجل. اخلطي المزيج على المغذيات في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات أو طوال الليل.
انقل جميع الملاط السائل والهلام إلى عمود مرشح 0.22 ميكرومتر وأجهزة طرد مركزي عند 10000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قم بتنزيل الشفرة المصدرية لتحليل CUT & RUN من صفحة GitHub بالنقر فوق الزر "التعليمات البرمجية الخضراء" ، متبوعا بخيار تنزيل ZIP. قم بفك ضغط المجلد إلى موقع ذي صلة على الجهاز المحلي.
قم بتثبيت بيئة Conda وتشغيلها مرة واحدة فقط. بمجرد تثبيت Conda ، قم بإنشاء بيئة افتراضية مزودة بالأمر ذي الصلة. قم بتنشيط البيئة الظاهرية في كل مرة يتم فيها تنفيذ سير العمل هذا.
تم تقييم هضم جدار الخلية والسلامة النووية من خلال تصور كل من الخلايا السليمة الضابطة والنوى المعزولة الملطخة بجدار الخلية الفلورسنت وبقع الحمض النووي. على النقيض من النوى السليمة المعزولة حيث لا يلاحظ تلطيخ جدار الخلية ، يتم تصنيف كل من النوى وجدران الخلايا بشكل فلوري في خلايا التحكم السليمة. يوضح الشكل مكتبات CUT & RUN TF التي تم تحليلها باستخدام أداة الرحلان الكهربائي الشعري.
يتم إثراء مكتبات CUT & RUN TF الناجحة لشظايا قصيرة أصغر من 200 زوج أساسي. تظهر مكتبات CUT & RUN TF دون المستوى الأمثل إثراء لشظايا الحمض النووي الكبيرة. يوضح الشكل الوارد هنا أن زخارف ربط الحمض النووي Ndt80 يتم إثراؤها عبر جميع المواقع المرتبطة ب Ndt80 التي حددتها CUT & RUN ، مما يشير إلى أن القمم الإضافية التي حددتها هذه المنهجية من المحتمل أن تكون مواقع مرتبطة ب Ndt80.
أشار التحليل المقارن إلى أن بروتوكول CUT & RUN حدد معظم أحداث الربط المعروفة سابقا ل Ndt80 و Efg1 أثناء تكوين الأغشية الحيوية. بشكل عام ، يتداخل كل من Ndt80 و Efg1 المرتبطين بالموقع مع بيانات ChIP لهطول الأمطار المناعية للكروماتين المنشورة سابقا ويتم تحديدها فقط باستخدام CUT & RUN. إنها تمكننا من زيادة نطاق ووتيرة أبحاثنا التي تركز على الشبكات التنظيمية النسخية والمبيضات البيضاء بشكل كبير.
