Этот протокол детализирует все экспериментальные процедуры, от эпитопной маркировки генов, кодирующих фактор транскрипции, до анализа вычислительных данных, до выполнения общегеномного профилирования взаимодействий транскрипционного фактора и ДНК в Candida albicans через CUT & RUN. Это более доступный, быстрый, более чувствительный, менее дорогой метод и обеспечивает более высокое качество данных, чем традиционные подходы ChIP-чипа и ChIP-seq. Хотя наш протокол разработан для клеток Candida albicans, выделенных из биопленок или планктонных культур, должно быть практично адаптировать его практически к любой хорошей форме клеток Candida albicans.
После инкубации клеточной суспензии переложите пятимикролитровую аликвоту в новую ПЦР-трубку. К пяти микролитрам изолированных ядер и пятимикролитной аликвоте интактных клеток, ранее хранившихся при четырех градусах Цельсия, добавляют по одному микролитру калькофтор-белого и SYTO 13. Инкубировать при температуре 30 градусов Цельсия в темноте в течение 30 минут.
Визуально проверьте целостность и чистоту изолированных ядер с помощью флуоресцентного микроскопа. Ищите изолированные ядра, показывающие заметное окрашивание SYTO 13, и убедитесь, что клеточная стенка не окрашивается калькофтор-белым красителем. Повторите проверку с неповрежденными клетками в качестве контроля для окрашивания клеточной стенки калькофтор-белым красителем.
Поместите трубки на магнитную стойку и подождите, пока суспензия полностью очистится. Выбросьте супернатант с помощью пипетки. Добавьте 50 микролитров буфера антител и аккуратно перемешайте путем пипетирования.
Добавьте три микролитра анти-GFP поликлонального антитела в пробирки и инкубируйте трубки на нутационном миксере при 4 градусах Цельсия в течение двух часов. Кратковременно центрифугируйте трубки в 100 раз г при комнатной температуре в течение пяти секунд и поместите трубки на магнитную стойку. Как только суспензия очистится, выбросьте супернатант с помощью пипетки.
Пока трубки с бусинами все еще находятся на магнитной стойке, добавьте 200 микролитров буфера проницаемости ледяных клеток непосредственно на бусины. Выбросьте супернатант с помощью пипетки. Повторите две промывки с буфером проницаемости ледяной ячейки.
Добавьте 50 микролитров буфера пермеабилизации ледяной ячейки в каждую трубку и аккуратно перемешайте путем пипетки. Добавьте 2,5 микролитра белка AG-MNase к каждому образцу и перемешайте путем пипетирования. Поместите образцы на нутационный миксер при температуре 4 градуса Цельсия и инкубируйте образцы в течение одного часа.
Кратковременно центрифугируйте ленточные трубки в 100 раз г при комнатной температуре в течение пяти секунд, затем поместите трубки на магнитную стойку. Как только суспензия очистится, выбросьте супернатант с помощью пипетки. Пока трубки с бусинами все еще находятся на магнитной стойке, добавьте 200 микролитров буфера проницаемости ледяных клеток непосредственно на бусины.
Выбросьте супернатант с помощью пипетки. Повторите две промывки с буфером проницаемости ледяной ячейки. Добавьте 100 микролитров буфера пермеабилизации ледяной ячейки к образцам и аккуратно пипеткой вверх и вниз пять раз.
Снимите гелевую отливку с гелевой коробки и откройте гелевую отливку в соответствии с инструкциями производителя. Аккуратно извлеките гель из гелевой отливки и поместите его в гелеудерживающий лоток, содержащий 100 миллилитров однопрочного TBE. Добавьте в лоток 10 микролитров гелевого пятна нуклеиновой кислоты и аккуратно закрутите.
Накрыть фольгой для защиты от света и высиживать статически при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем дважды промойте гель 100 миллилитрами деионизированной водопроводной воды. Изобразите гель под синей подсветкой с помощью янтарной крышки фильтра.
Для каждой библиотеки отрежьте гель немного выше примерно 125 базовых пар выступающих димерных диапазонов адаптера и ниже лестничной отметки 400 пар оснований. Проколите дно 0,65-миллилитровой трубки с помощью иглы 22-го калибра и поместите проколотую трубку внутрь стерильной двухмиллилитровой микрофьюжной трубки. Переложите ломтик геля в проколотую трубку внутри двухмиллилитровой микрофьюжной трубки.
Центрифугируйте двухмиллилитровую микрофрагменную трубку, содержащую проколотую трубку 0,65 миллилитра и образец в 10 000 раз г при комнатной температуре в течение двух минут, чтобы собрать гелевую суспензию внутри двухмиллилитровой микрофьюжной трубки. Добавьте 300 микролитров ледяного гелевого буфера элюирования в гелевую суспензию. Смешивать на нутризаторе при комнатной температуре не менее трех часов или на ночь.
Переложите всю жидкую и гелевую суспензию в фильтрующую колонну 0,22 микрометра и центрифугу при 10 000 г при комнатной температуре в течение одной минуты. Загрузите исходный код для анализа CUT&RUN со страницы GitHub, нажав на зеленую кнопку Code, а затем опцию Download ZIP. Распакуйте папку в нужное место на локальном компьютере.
Установите среду Conda и запустите ее только один раз. После установки Conda создайте виртуальную среду с соответствующей командой. Активируйте виртуальную среду каждый раз при выполнении этого рабочего процесса.
Пищеварение клеточной стенки и ядерную целостность оценивали путем визуализации как контрольных неповрежденных клеток, так и изолированных ядер, окрашенных флуоресцентной клеточной стенкой и пятнами нуклеиновых кислот. В отличие от изолированных интактных ядер, где окрашивание клеточной стенки не наблюдается, и ядра, и клеточные стенки флуоресцентно мечено мечены в интактных контрольных клетках. На рисунке показаны библиотеки CUT&RUN TF, проанализированные с помощью инструмента капиллярного электрофореза.
Успешные библиотеки CUT&RUN TF обогащаются короткими фрагментами размером менее 200 пар оснований. Субоптимальные библиотеки CUT&RUN TF показывают обогащение для больших фрагментов ДНК. Рисунок здесь показывает, что ДНК-связывающие мотивы Ndt80 обогащаются во всех Ndt80-связанных локусах, идентифицированных CUT&RUN, что указывает на то, что дополнительные пики, идентифицированные этой методологией, вероятно, являются добросовестными сайтами, связанными с Ndt80.
Сравнительный анализ показал, что протокол CUT&RUN идентифицировал большинство ранее известных событий связывания для Ndt80 и Efg1 во время формирования биопленки. В целом, как Ndt80, так и Efg1 связаны с локусами, перекрываются с ранее опубликованными данными ChIP иммунного осаждения хроматина и идентифицируются только с использованием CUT & RUN. Это позволяет нам значительно увеличить объем и темпы наших исследований, ориентированных на транскрипционные регуляторные сети и Candida albicans.
