Este protocolo detalha todos os procedimentos experimentais, desde a marcação de epitope de genes de codificação de fatores de transcrição através da análise de dados computacionais, até a realização de um perfil em todo o genoma das interações de vinculação fator de transcrição-DNA em albicanos candida via CUT&RUN. Esta é uma técnica mais acessível, mais rápida, mais sensível e menos cara, e fornece dados de maior qualidade do que as abordagens tradicionais de chip-chip e ChIP-seq. Embora nosso protocolo seja desenvolvido para células de candida albicans isoladas de biofilmes ou culturas planctônicas, deve ser prático adaptá-lo a praticamente qualquer boa forma de células de candida albicans.
Depois de incubar a suspensão celular, transfira uma alíquota de cinco microliter para um novo tubo PCR. A cinco microlitadores de núcleos isolados e uma alíquota de cinco microlitrais de células intactas anteriormente armazenadas a quatro graus Celsius, adicione um microliter cada um de calcofluor-branco e SYTO 13. Incubar a 30 graus Celsius no escuro por 30 minutos.
Inspecione visualmente a integridade e a pureza dos núcleos isolados usando um microscópio de fluorescência. Procure por núcleos isolados que mostrem manchas proeminentes SYTO 13 e garanta que não haja manchas na parede celular pelo corante branco-calcofluor. Repita a inspeção com células intactas como um controle para coloração da parede celular com corante branco-calcofluor.
Coloque os tubos em um rack magnético e espere até que o chorume esteja completamente limpo. Descarte o supernatante usando uma pipeta. Adicione 50 microliters do tampão de anticorpos e misture suavemente por pipetação.
Adicione três microliters do anticorpo policlonal anti-GFP aos tubos e incubar os tubos em uma batedeira de nozes a 4 graus Celsius por duas horas. Centrifufique brevemente os tubos a 100 vezes g à temperatura ambiente por cinco segundos e coloque os tubos em um rack magnético. Uma vez que o chorume esteja limpo, descarte o supernatante usando uma pipeta.
Enquanto os tubos com as contas ainda estão no rack magnético, adicione 200 microliters de tampão de permeabilização de células geladas diretamente nas contas. Descarte o supernatante usando uma pipeta. Repita duas lavagens com o tampão de permeabilização de células geladas.
Adicione 50 microliters de tampão de permeabilização de células geladas a cada tubo e misture suavemente por pipetação. Adicione 2,5 microliters da proteína AG-MNase a cada amostra e misture por pipetação. Coloque as amostras em uma batedeira de nozes a 4 graus Celsius e incuba as amostras por uma hora.
Centrifufique brevemente os tubos de tira a 100 vezes g em temperatura ambiente por cinco segundos, em seguida, coloque os tubos em um rack magnético. Uma vez que o chorume esteja limpo, descarte o supernatante usando uma pipeta. Enquanto os tubos com as contas ainda estão no rack magnético, adicione 200 microliters de tampão de permeabilização de células geladas diretamente nas contas.
Descarte o supernatante usando uma pipeta. Repita duas lavagens com o tampão de permeabilização de células geladas. Adicione 100 microlitadores do tampão de permeabilização de células geladas às amostras e aplique suavemente para cima e para baixo cinco vezes.
Remova o molde de gel da caixa de gel e abra o gel lançado de acordo com as instruções do fabricante. Retire suavemente o gel do molde de gel e coloque-o dentro de uma bandeja de gel contendo 100 mililitros de TBE de força única. Adicione 10 microliters da mancha de gel ácido nucleico à bandeja e gire suavemente.
Cubra com papel alumínio para proteger da luz e incubar estaticamente à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, enxágue o gel duas vezes com 100 mililitros de água da torneira deionizada. Imagem do gel sob iluminação de luz azul usando uma tampa de filtro âmbar.
Para cada biblioteca, corte o gel ligeiramente acima da faixa de adaptador proeminente do par de aproximadamente 125 bases e abaixo da marca de escada do par de 400 bases. Puna a parte inferior de um tubo de 0,65 mililitro usando uma agulha de calibre 22 e coloque o tubo perfurado dentro de um tubo microfuge de dois mililitros estérei. Transfira a fatia de gel para o tubo perfurado dentro do tubo de microfuça de dois mililitros.
Centrifugar o tubo de microfuça de dois mililitros contendo o tubo perfurado de 0,65 mililitro e a amostra a 10.000 vezes g à temperatura ambiente por dois minutos para coletar o chorume de gel dentro do tubo de microfuça de dois mililitros. Adicione 300 microliters de amortecedor de gel gelado ao chorume de gel. Misture um nutador à temperatura ambiente por um mínimo de três horas ou durante a noite.
Transfira todo o chorume líquido e gel para uma coluna de filtro de 0,22 micrômetros e centrífuga a 10.000 vezes g à temperatura ambiente por um minuto. Baixe o código-fonte para a análise CUT&RUN da página do GitHub clicando no botão código verde, seguido pela opção Download ZIP. Descompacte a pasta para um local relevante na máquina local.
Instale o Conda Environment e execute apenas uma vez. Uma vez instalado o Conda, crie um ambiente virtual fornecido com o comando relevante. Ative o ambiente virtual toda vez que esse fluxo de trabalho for executado.
A digestão da parede celular e a integridade nuclear foram avaliadas pela visualização de células intactas de controle e núcleos isolados manchados com parede celular fluorescente e manchas de ácido nucleico. Em contraste com os núcleos intactos isolados onde a coloração da parede celular não é observada, tanto os núcleos quanto as paredes celulares são fluorescentes rotulados nas células de controle intactas. A figura mostra bibliotecas CUT&RUN TF analisadas usando um instrumento de eletroforese capilar.
As bibliotecas de TF de sucesso da CUT&RUN são enriquecidas para fragmentos curtos menores que 200 pares de bases. Bibliotecas TF subótidas da CUT&RUN mostram enriquecimento para grandes fragmentos de DNA. O número aqui mostra que os motivos de vinculação de DNA do Ndt80 são enriquecidos em todos os locis ligados ao Ndt80 identificados pela CUT&RUN, indicando que os picos adicionais identificados por essa metodologia são provavelmente sites vinculados a Bonafide Ndt80.
A análise comparativa indicou que o protocolo CUT&RUN identificou a maioria dos eventos de vinculação previamente conhecidos para Ndt80 e Efg1 durante a formação de biofilmes. No geral, tanto o Ndt80 quanto o Efg1 são obrigados a loci sobrepor-se com os dados de precipitação imunológica de cromatina publicados anteriormente e são identificados apenas usando o CUT&RUN. Isso nos permite aumentar significativamente o escopo e o ritmo de nossa pesquisa focada em redes regulatórias transcricionais e albicanos candida.
