يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام المواد العضوية المعوية المشتقة من الخزعة وتكنولوجيا الأعضاء على الشريحة لتوليد شريحة الأمعاء ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والتي يمكن استخدامها بعد ذلك للتنبؤ بالحرائك الدوائية والتفاعل بين الأدوية والأدوية ودراسة خلل الحاجز الظهاري المعوي. يسمح لنا توحيد المواد العضوية في تقنية الأعضاء على الرقاقة بإعادة إنتاج تعقيد الظهارة المعوية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتيح تحكما تجريبيا أكبر في الإشارات الميكانيكية وتوزيع التدفق والتدرجات الكيميائية الحيوية.
تحاكي هذه الطريقة الفسيولوجيا المعقدة للأمعاء البشرية ، مما يعطي فهما أكبر للأساس الخلوي والجزيئي لوظائف الأمعاء الطبيعية والمرضية. هذا يساعد على التنبؤ بشكل أفضل الحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية والأدوية المرشحة المحتملة لمنع الأضرار الالتهابية. البذر هو خطوة حاسمة في البروتوكول.
قد يؤدي التفتيت المفرط أو كثافة البذر غير الدقيقة للشظايا العضوية المعوية إلى الإضرار بتطور الحاجز الظهاري وتمايزه. للبدء ، استنشق الوسط من الثقافة العضوية الثابتة. استعادة الوسائط من آبار كافية لتحقيق كثافة بذر نهائية تبلغ ثمانية ملايين خلية لكل ملليلتر.
أضف 500 ميكرولتر من محلول تفكك BMM البارد على الجليد إلى كل بئر وقم بتوصيل BMM المذاب من سطح البئر. اجمع التعليق في أنبوب ربط منخفض البروتين سعة 15 ملليلتر وضعه على الجليد. رج الأنبوب بلطف كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة.
جهاز طرد مركزي بسرعة 300 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على بيليه عضوي. إذا لوحظت طبقة هلام شفافة فوق الكريات ، فقم بشفط المحلول من الأنبوب. أعد تعليق الكريات وأضف حجما متساويا من محلول تفكك BMM.
احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق وأجهزة الطرد المركزي. كرر ذلك حتى لا توجد بقايا BMM قابلة للذوبان. ثم تخلص من supernatant وأعد تعليق الكريات في ملليلترين من محلول الهضم العضوي.
احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق وأضف ثمانية ملليلترات من DMEM F12 المتقدم لإيقاف التفاعل الإنزيمي. جهاز طرد مركزي وإعادة تعليق الكريات في وسط نمو عضوي كامل لتحقيق ثمانية ملايين خلية لكل ملليلتر. Aliquot 360 ميكرولتر في أنابيب ربط معقمة 1.5 ملليلتر منخفضة البروتين.
بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط من القناة العلوية للرقائق المطلية وإضافة 30 ميكرولتر من تعليق الخلية. احتضان الرقائق عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لالتصاق شظايا العضوية بالغشاء. أضف ثلاثة ملليلترات من وسط النمو العضوي الكامل المتوازن مسبقا إلى خزان المدخل العلوي وثلاثة ملليلترات من وسط نمو الخلايا البطانية المتوازن مسبقا في خزان المدخل السفلي.
أضف 300 ميكرولتر من نفس الوسائط في خزانات المخرج العلوية والسفلية المعنية. انقل الدرج الذي يحمل الوحدات المحمولة إلى وحدة الثقافة. في وحدة الثقافة ، قم بتشغيل الدورة الرئيسية بشكل متكرر حتى تتشكل قطرات كافية لتوصيل الرقائق بنجاح.
ثم حرك حامل الشريحة في الوحدة المحمولة. ثم ابدأ دورة التنظيم التي تستغرق ساعتين للضغط على وسائط الثقافة في الوحدة المحمولة والرقاقة وبعد ذلك ستستأنف الظروف المبرمجة. بعد ذلك ، قم بتغيير إعدادات التمدد وابدأ وحدة الثقافة.
بعد 24 ساعة ، كرر الدورة مع تمدد 10٪ ونفس التردد. لإعداد وسائط الجرعات أو التحكم في السيارة ، قم بتخفيف حلول مخزون محفز CYP أو DMSO في وسط نمو عضوي كامل ووسط نمو الخلايا البطانية. أوقف وحدة الاستزراع مؤقتا وأحضر الصواني إلى خزانة السلامة الأحيائية.
استبدل الوسائط في جميع خزانات المدخل والمخرج بملليلترين من وسائط الجرعات مع محفزات أو التحكم في السيارة. أعد الوحدات المحمولة مرة أخرى إلى وحدة الثقافة وأعد تشغيل التدفق بسرعة 30 ميكرولتر في الساعة. استبدل الوسائط بمحلول محفز طازج كل 24 ساعة واستمر في الثقافة لمدة 48 إلى 72 ساعة.
ثم أحضر الصواني إلى خزانة السلامة الأحيائية واستنشق وسط الجرعات من جميع الخزانات. اغسل واستبدال خزان المدخل العلوي بوسط DMEM F12 المتقدم الدافئ والخزان السفلي بوسط نمو الخلايا البطانية. استبدل وسط الغسيل بملليلتر واحد من محلول ركيزة المسبار.
قم بدمج الرقائق بمعدل تدفق مرتفع يبلغ 1000 ميكرولتر في الساعة لمدة خمس دقائق وقم بشفط كل من خزانات المخرج العلوية والسفلية. أعد الرقائق إلى وحدة الثقافة واحتضنها لمدة ساعة واحدة تحت تدفق مستمر يبلغ 300 ميكرولتر في الساعة. بعد ساعة واحدة من العلاج ، أوقف التدفق وأحضر الصواني إلى خزانة السلامة الأحيائية.
جمع 100 ميكرولتر من النفايات السائلة من خزان المخرج العلوي وإضافته إلى أنبوب يحتوي على 200 ميكرولتر من محلول التوقف. ضع الأنابيب فورا على الثلج الجاف وخزن العينات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من DPBS المعقمة.
ثم قم بحظر منفذ القناة السفلية بطرف ماصة مرشح سعة 200 ميكرولتر. قم بدمج 50 ميكرولتر من محلول التفكك من خلال القناة السفلية واحتضنها لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تأكد من الانفصال الكامل للخلايا البطانية وإزالة محلول التفكك من القناة عن طريق السحب.
كرر الغسيل. بعد ذلك ، قم بحظر منفذ القناة العلوي وقم بأداء 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل البروتين. اترك طرف الماصة مدرجا واحتضنه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
اجمع التحلل الخلوي في أنبوب 1.5 ملليلتر عن طريق السحب من خمس إلى 10 مرات. كرر التروية والتجميع للحصول على انفصال كامل للخلايا وتخزين الليزات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى التحليل. بالنسبة لتحليل الحمض النووي الريبي، اتبع نفس الإجراء أثناء استخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي.
أولا ، قم بإعداد محلول جرعات الإنترفيرون غاما عن طريق تخفيف محاليل المخزون في وسط نمو الخلايا البطانية المنزوعة الغاز. في خزانة السلامة الأحيائية ، قم بإزالة الوسط من خزانات مدخل القناة السفلية واستبدله بثلاثة ملليلترات من محلول الجرعات يوميا. ثم ضع الصواني في وحدة الثقافة وقم بأداء الرقائق بمعدل تدفق مرتفع يبلغ 1000 ميكرولتر في الساعة لمدة خمس دقائق.
قم بتبديل معدل التدفق إلى 60 ميكرولتر في الساعة واستمر في الثقافة السائلة. أضف 100 ميكرولتر من DPBS لكل بئر في لوحة سوداء ذات جدران 96 بئرا. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 50 ميكرولتر من النفايات السائلة من جميع الخزانات إلى الآبار المعنية.
لإعداد منحنى قياسي ، قم بإجراء تخفيف ثلاثي الأضعاف للوسط الذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من ثلاثة كيلودالتون ديكستران شلال أزرق في DPBS. ثم قم بإجراء أوهام تسلسلية باستخدام تخفيف ثلاثي الأضعاف لوسط نمو الخلايا البطانية في DPBS. تم تسليط الضوء على السمات المورفولوجية المميزة لرقائق الاثني عشر والقولون من خلال وجود تكوينات تشبه الزغب في رقاقة الاثني عشر تمثل بنية الأمعاء الدقيقة.
في رقاقة الاثني عشر المعرضة لمحفزات السيتوكروم P450 ريفامبيسين وفيتامين D3 ، كان هناك تعبير جيني mRNA مرتفع لإنزيم استقلاب الدواء السيتوكروم P450 3A4 وتعزيز النشاط الحفاز لإنزيم السيتوكروم P450 ، مما يشير إلى استجابات حثية مناسبة عبر جميع المتبرعين العضويين الثلاثة. عند معالجة الطبقة الظهارية الأحادية لرقاقة القولون بجاما الإنترفيرون ، لوحظ مورفولوجيا الخلية المعرضة للخطر وفقدان الظهارة العمودية. أيضا ، أدى العلاج بجاما الإنترفيرون إلى زيادة الإشارة السيتوبلازمية لبروتينات الوصلة الضيقة والملتصقة مقارنة بالتحكم في السيارة ، مما يدل على إزاحة علامات التقاطع الضيقة ZO-1 و claudin 4 واستيعاب occludin و E-cadherin.
لوحظت زيادة كبيرة في نفاذية الظهارة شبه الخلوية بعد 48 ساعة من تحفيز غاما الإنترفيرون على رقائق القولون. وبالمثل ، يحفز جاما الإنترفيرون تنشيط موت الخلايا المبرمج المشار إليه بزيادة المحتوى داخل الخلايا في Caspase 3 المشقوق. تسبب جاما الإنترفيرون في إفراز مستقطب للجزيئات المؤيدة للالتهابات في رقاقة القولون كما هو موضح في الإفراز القاعدي الجانبي ل VCAM-1 و interleukin-6 والإفراز القمي ل ICAM-1 وبروتين أميلويد المصل A.للحصول على ثقافة رقائق الأمعاء الناجحة ، يجب على المرء استخدام المواد العضوية غير المتمايزة واتباع تعليمات كثافة التجزئة والبذر.
بعد الإنشاء الناجح لشريحة الأمعاء ، يمكننا دراسة امتصاص الأمعاء ونقلها والتمثيل الغذائي ، ومستويات المغذيات ، وإفراز الهرمونات المعوية ، وتفاعلات مسببات الأمراض الميكروبية المضيفة ، وسلامة الأدوية وفعاليتها ، وآليات المرض الخاصة بالمريض ، والاستجابات للعلاجات.
