이 프로토콜은 생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술을 사용하여 생리학적으로 관련된 장 칩을 생성한 다음 약동학 및 약물-약물 상호 작용을 예측하고 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. organ-on-a-chip 기술에 유기체를 결합하면 장 상피의 복잡성을 재현 할 수 있습니다. 또한 기계적 단서, 유동 분포 및 생화학적 구배에 대한 더 큰 실험적 제어를 가능하게 합니다.
이 방법은 인간 장의 복잡한 생리학을 모방하여 정상 및 병리학 적 장 기능의 세포 및 분자 적 기초에 대한 더 큰 이해를 제공합니다. 이는 약동학 및 약력학을 더 잘 예측하고 염증 손상을 예방할 수 있는 잠재적 약물 후보를 예측하는 데 도움이 됩니다. 시드는 프로토콜에서 중요한 단계입니다.
장 오가노이드 단편의 과도한 단편화 또는 부정확한 파종 밀도는 상피 장벽의 발달 및 분화를 손상시킬 수 있습니다. 시작하려면 정적 오가노이드 배양에서 배지를 흡입합니다. 밀리리터당 800만 세포의 최종 파종 밀도를 달성하기 위해 충분한 웰에서 배지를 회수합니다.
500 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 BMM 해리 용액을 각 웰에 첨가하고 가용화된 BMM을 웰 표면으로부터 부착한다. 현탁액을 15 밀리리터의 저 단백질 결합 튜브에 모아서 얼음 위에 놓습니다. 1 시간 동안 15 분마다 튜브를 부드럽게 흔 듭니다.
섭씨 4도에서 5분 동안 G를 300배로 원심분리하여 오가노이드 펠렛을 얻었다. 펠릿 위에 투명한 겔 층이 관찰되면 튜브에서 용액을 흡입하십시오. 펠릿을 다시 현탁시키고 동일한 부피의 BMM 해리 용액을 추가합니다.
얼음 위에서 10 분 동안 배양하고 원심 분리합니다. 가용화된 BMM 잔류물이 없을 때까지 반복합니다. 그런 다음 상청액을 버리고 2 밀리리터의 오가노이드 소화 용액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.
튜브를 섭씨 37도에서 1-3 분 동안 배양하고 8 밀리리터의 고급 DMEM F12를 추가하여 효소 반응을 중지시킵니다. 펠릿을 원심분리하고 완전한 오가노이드 성장 배지에 재현탁하여 밀리리터당 800만 개의 세포를 달성합니다. 분취량 360 마이크로리터를 멸균 1.5 밀리리터 저단백질 결합 튜브에 담았습니다.
다음으로, 코팅된 칩의 상단 채널로부터 배지를 제거하고 30 마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가한다. 칩을 섭씨 37도에서 밤새 배양하여 오가노이드 조각을 막에 부착시킵니다. 3 밀리리터의 사전 평형 된 완전한 유기체 성장 배지를 상단 입구 저장소에 추가하고 3 밀리리터의 사전 평형 된 내피 세포 성장 배지를 하단 입구 저장소에 추가합니다.
각각의 상단 및 하단 배출구 저장소에 동일한 매체 300 마이크로 리터를 추가하십시오. 휴대용 모듈을 운반하는 트레이를 배양 모듈로 옮깁니다. 배양 모듈에서 칩을 성공적으로 연결하기에 충분한 액적이 형성될 때까지 프라임 사이클을 반복적으로 실행합니다.
그런 다음 칩 캐리어를 휴대용 모듈에 밀어 넣습니다. 그런 다음 2시간의 긴 조절 주기를 시작하여 휴대용 모듈과 칩의 배양 배지에 압력을 가한 후 프로그래밍된 조건이 다시 시작됩니다. 다음으로, 스트레치 설정을 변경하고 문화권 모듈을 시작합니다.
24 시간 후, 10 % 스트레칭과 동일한 빈도로주기를 반복하십시오. 투여 배지 또는 비히클 대조군을 준비하기 위해, CYP 유도제 스톡 용액 또는 DMSO를 완전한 오가노이드 성장 배지 및 내피 세포 성장 배지로 희석한다. 배양 모듈을 일시 중지하고 트레이를 생물안전 캐비닛으로 가져옵니다.
모든 입구 및 출구 저장소의 매체를 인덕터 또는 차량 제어 장치가 있는 2밀리리터의 투여 매체로 교체하십시오. 휴대용 모듈을 배양 모듈로 다시 돌려보내고 시간당 30마이크로리터로 흐름을 다시 시작합니다. 배지를 24시간마다 새로 준비된 유도 용액으로 교체하고 48 내지 72시간 동안 배양을 계속한다.
그런 다음 트레이를 생물 안전 캐비닛으로 가져 와서 모든 저장소에서 투여 매체를 흡입하십시오. 세척하고 상단 입구 저장소를 따뜻한 고급 DMEM F12 배지로 교체하고 하단 저장소를 내피 세포 성장 배지로 교체합니다. 세척 매체를 1 밀리리터의 프로브 기판 용액으로 교체하십시오.
칩을 시간당 1, 000 마이크로 리터의 높은 유속으로 5 분 동안 관류하고 상단 및 하단 출구 저장소를 모두 흡입하십시오. 칩을 배양 모듈로 되돌리고 시간당 300 마이크로 리터의 일정한 흐름 하에서 1 시간 동안 배양한다. 1 시간의 치료 후, 흐름을 멈추고 트레이를 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다.
상단 출구 저장소에서 100 마이크로 리터의 유출 물을 수집하고 200 마이크로 리터의 정지 용액이 들어있는 튜브에 첨가하십시오. 튜브를 즉시 드라이 아이스에 놓고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 200 마이크로 리터의 멸균 DPBS로 두 채널을 모두 세척하십시오.
그런 다음 200 마이크로 리터 필터 피펫 팁으로 하단 채널 배출구를 막습니다. 50 마이크로리터의 해리 용액을 바닥 채널을 통해 관류시키고 실온에서 2분 동안 배양한다. 내피 세포의 완전한 분리를 보장하고 피펫팅으로 채널에서 해리 용액을 제거합니다.
세척을 반복하십시오. 다음으로, 상단 채널 배출구를 차단하고 75 마이크로 리터의 단백질 용해 완충액을 관류하십시오. 피펫 팁을 삽입한 상태로 두고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
세포 용해물을 1.5 밀리리터 튜브에 5 내지 10회 피펫팅하여 수집한다. 관류 및 수집을 반복하여 세포의 완전한 분리를 얻고 분석될 때까지 용해물을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. RNA 용해의 경우 150마이크로리터의 RNA 용해 완충액을 사용하면서 동일한 절차를 따르십시오.
먼저, 원액을 탈기된 내피세포 성장 배지에 희석하여 인터페론 감마 투여 용액을 제조한다. 생물안전 캐비닛에서 하단 채널 입구 저장소에서 배지를 제거하고 매일 3밀리리터의 투여 용액으로 교체합니다. 그런 다음 트레이를 배양 모듈에 넣고 칩을 시간당 1, 000 마이크로 리터의 높은 유속으로 5 분 동안 관류하십시오.
유속을 시간당 60 마이크로 리터로 전환하고 유체 배양을 계속하십시오. 웰당 100마이크로리터의 DPBS를 96웰 검은색 벽 플레이트에 추가합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 모든 저장소에서 각 웰에 50 마이크로 리터의 유출 물을 추가합니다.
표준 곡선을 제조하기 위해, DPBS 중 밀리리터당 100 마이크로그램의 3킬로달톤 덱스트란 캐스케이드 블루를 함유하는 배지의 3배 희석을 수행한다. 그런 다음 DPBS에서 내피 세포 성장 배지의 3 배 희석을 사용하여 연속 망상을 수행하십시오. 십이지장 및 결장 칩의 뚜렷한 형태 학적 특징은 소장의 구조를 나타내는 십이지장 칩에 융모와 같은 형성의 존재에 의해 강조되었습니다.
시토크롬 P450 유도제 리팜피신 및 비타민 D3에 노출된 십이지장 칩에서 약물 대사 효소 시토크롬 P450 3A4에 대한 mRNA 유전자 발현이 상승하고 시토크롬 P450 효소의 촉매 활성이 향상되어 3가지 오가노이드 공여체 모두에 걸쳐 적절한 유도 반응을 나타냅니다. 결장 칩의 상피 단층을 인터페론 감마로 처리했을 때, 손상된 세포 형태 및 원주 상피의 손실이 관찰되었다. 또한, 인터페론 감마로 처리하면 비히클 대조군에 비해 단단하고 부착 접합 단백질의 세포질 신호가 증가하여 단단한 접합 마커 ZO-1 및 클라우딘 4의 변위와 폐색 및 E-카드헤린의 내재화를 보여줍니다.
상피 세포 투과성의 현저한 증가는 결장 칩에 대한 인터페론 감마 자극 48 시간 후에 관찰되었다. 유사하게, 인터페론 감마는 절단된 Caspase 3의 세포내 함량의 증가에 의해 지시되는 세포자멸사의 활성화를 유도한다. 인터페론 감마는 VCAM-1 및 인터루킨-6의 기저측 분비와 ICAM-1 및 혈청 아밀로이드 단백질의 정점 분비에서 볼 수 있듯이 결장 칩에서 전염증성 분자의 분극 분비를 유도했습니다.
장 칩의 성공적인 확립에 따라 장 흡수, 수송 및 대사, 영양소 수준 및 장 호르몬 분비, 숙주 미생물 병원체 상호 작용, 약물 안전성 및 효능, 환자 별 질병 메커니즘 및 치료법에 대한 반응을 연구 할 수 있습니다.
