Bu protokol, biyopsi kaynaklı intestinal organoidlerin ve çip üzerinde organ teknolojisinin, farmakokinetiği ve ilaç-ilaç etkileşimini tahmin etmek ve bağırsak epitel bariyeri disfonksiyonunu incelemek için kullanılabilecek fizyolojik olarak ilgili bir bağırsak çipi oluşturmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Organoidleri çip üzerinde organ teknolojisinde birleştirmek, bağırsak epitelinin karmaşıklığını yeniden üretmemize izin verir. Ek olarak, mekanik ipuçlarının, akış dağılımının ve biyokimyasal gradyanların daha fazla deneysel kontrolünü sağlar.
Bu yöntem, insan bağırsağının karmaşık fizyolojisini taklit ederek, normal ve patolojik bağırsak fonksiyonlarının hücresel ve moleküler temelini daha iyi anlamasını sağlar. Bu, farmakokinetiğin ve farmakodinamiğin ve enflamatuar hasarı önlemek için potansiyel ilaç adaylarının daha iyi tahmin edilmesine yardımcı olur. Tohumlama, protokolde kritik bir adımdır.
Bağırsak organoid fragmanlarının aşırı parçalanması veya yanlış tohumlama yoğunluğu, epitel bariyerinin gelişimini ve farklılaşmasını tehlikeye atabilir. Başlamak için, ortamı statik organoid kültürden aspire edin. Mililitre başına sekiz milyon hücrelik nihai bir tohumlama yoğunluğu elde etmek için yeterli kuyudan medyayı geri kazanın.
Her bir kuyucuğa 500 mikrolitre buz gibi soğuk BMM ayrışma çözeltisi ekleyin ve çözünür BMM'yi kuyu yüzeyinden çıkarın. Süspansiyonu 15 mililitrelik düşük proteinli bir bağlama tüpüne toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Tüpü bir saat boyunca her 15 dakikada bir yavaşça sallayın.
Bir organoid pelet elde etmek için dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. Pelet üzerinde şeffaf bir jel tabakası gözlenirse, tüpten aspirat çözeltisi. Peleti yeniden askıya alın ve eşit miktarda BMM ayrışma çözeltisi ekleyin.
10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatışın ve santrifüj yapın. Çözünür BMM kalıntıları kalmayana kadar tekrarlayın. Daha sonra süpernatantı atın ve peleti iki mililitre organoid sindirim çözeltisi içinde yeniden askıya alın.
Tüpü bir ila üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için sekiz mililitre gelişmiş DMEM F12 ekleyin. Mililitre başına sekiz milyon hücre elde etmek için peleti tam organoid büyüme ortamında santrifüj yapın ve yeniden askıya alın. Aliquot 360 mikrolitrelik steril 1.5 mililitre düşük proteinli bağlayıcı tüplerde.
Daha sonra, ortamı kaplanmış talaşların üst kanalından çıkarın ve 30 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Organoid parçalarını membrana yapıştırmak için çipleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Üst giriş rezervuarına üç mililitre önceden dengelenmiş tam organoid büyüme ortamı ve alt giriş rezervuarına üç mililitre önceden dengelenmiş endotel hücre büyüme ortamı ekleyin.
İlgili üst ve alt çıkış rezervuarlarına aynı ortamdan 300 mikrolitre ekleyin. Taşınabilir modülleri taşıyan tepsiyi kültür modülüne aktarın. Kültür modülünde, yongaları başarılı bir şekilde bağlamak için yeterli damlacık oluşana kadar asal döngüyü tekrar tekrar çalıştırın.
Ardından çip taşıyıcısını taşınabilir modüle kaydırın. Ardından, taşınabilir modül ve çipteki kültür ortamını basınçlandırmak için iki saat süren düzenleme döngüsünü başlatın ve ardından programlanan koşullar devam edecektir. Ardından, esnetme ayarlarını değiştirin ve kültür modülünü başlatın.
24 saat sonra, döngüyü% 10 germe ve aynı frekansla tekrarlayın. Dozaj ortamını veya araç kontrolünü hazırlamak için, CYP indükleyici stok çözeltilerini veya DMSO'yu tam organoid büyüme ortamında ve endotel hücre büyüme ortamında seyreltin. Kültür modülünü duraklatın ve tepsileri biyogüvenlik kabinine getirin.
Tüm giriş ve çıkış rezervuarlarındaki ortamı, indükleyiciler veya araç kontrolü ile iki mililitre dozaj ortamı ile değiştirin. Taşınabilir modülleri kültür modülüne geri döndürün ve akışı saatte 30 mikrolitrede yeniden başlatın. Ortamı her 24 saatte bir taze hazırlanmış indükleyici çözelti ile değiştirin ve kültüre 48 ila 72 saat devam edin.
Daha sonra tepsileri biyogüvenlik kabinine getirin ve dozaj ortamını tüm rezervuarlardan aspire edin. Üst giriş haznesini ılık gelişmiş DMEM F12 ortamı ile ve alt rezervuarı endotel hücre büyüme ortamı ile yıkayın ve değiştirin. Yıkama ortamını bir mililitre prob substrat çözeltisi ile değiştirin.
Talaşları beş dakika boyunca saatte 1.000 mikrolitrelik yüksek bir akış hızında perfüze edin ve hem üst hem de alt çıkış rezervuarlarını aspire edin. Talaşları kültür modülüne geri döndürün ve saatte 300 mikrolitrelik sabit bir akış altında bir saat boyunca inkübe edin. Bir saatlik işlemden sonra, akışı durdurun ve tepsileri biyogüvenlik kabinine getirin.
Üst çıkış rezervuarından 100 mikrolitre atık su toplayın ve 200 mikrolitre durdurma çözeltisi içeren bir tüpe ekleyin. Tüpleri hemen kuru buz üzerine yerleştirin ve numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Her iki kanalı da 200 mikrolitre steril DPBS ile yıkayın.
Ardından alt kanal çıkışını 200 mikrolitrelik filtre pipet ucuyla bloke edin. Ayrışma çözeltisinin 50 mikrolitresini alt kanaldan geçirin ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Endotel hücrelerinin tamamen ayrılmasını sağlayın ve pipetleme ile ayrışma çözeltisini kanaldan çıkarın.
Yıkamayı tekrarlayın. Ardından, üst kanal çıkışını bloke edin ve 75 mikrolitre protein lizis tamponunu perfüze edin. Pipet ucunu takılı bırakın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.
Hücre lizatlarını 1,5 mililitrelik bir tüpte beş ila 10 kez pipetleyerek toplayın. Hücrelerin tamamen ayrılmasını sağlamak için perfüzyon ve toplamayı tekrarlayın ve lizatları analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. RNA lizisi için, 150 mikrolitre RNA lizis tamponu kullanırken aynı prosedürü izleyin.
İlk olarak, stok çözeltilerini gazdan arındırılmış endotel hücresi büyüme ortamında seyrelterek bir interferon gama dozajlama çözeltisi hazırlayın. Biyogüvenlik kabininde, ortamı alt kanal giriş rezervuarlarından çıkarın ve günlük üç mililitre dozaj çözeltisi ile değiştirin. Daha sonra tepsileri kültür modülüne yerleştirin ve talaşları beş dakika boyunca saatte 1.000 mikrolitrelik yüksek bir akış hızında perfüze edin.
Akış hızını saatte 60 mikrolitreye değiştirin ve akışkan kültüre devam edin. 96 delikli siyah duvarlı bir plakaya kuyucuk başına 100 mikrolitre DPBS ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, tüm rezervuarlardan ilgili kuyucuklara 50 mikrolitre atık su ekleyin.
Standart bir eğri hazırlamak için, DPBS'de mililitre başına 100 mikrogram üç kilodalton dekstran kaskad mavisi içeren ortamın üç kat seyreltilmesini gerçekleştirin. Daha sonra DPBS'de endotel hücre büyüme ortamının üç kat seyreltilmesini kullanarak seri sanrılar gerçekleştirin. Duodenum ve kolon yongalarının farklı morfolojik özellikleri, ince bağırsağın mimarisini temsil eden duodenum çipindeki villus benzeri oluşumların varlığı ile vurgulanmıştır.
Sitokrom P450 indükleyicileri rifampisin ve D3 vitaminine maruz kalan duodenum çipinde, ilaç metabolize edici enzim sitokrom P450 3A4 için yüksek bir mRNA gen ekspresyonu ve sitokrom P450 enziminin katalitik aktivitesini arttırdı. Kolon çipinin epitel tek katmanının interferon gama ile tedavi edilmesinde hücre morfolojisinde bozulma ve kolumnar epitel kaybı gözlendi. Ayrıca, interferon gama ile tedavi, araç kontrolüne kıyasla sıkı ve yapışkan bağlantı proteinlerinin sitoplazmik sinyalinin artmasına yol açmış, sıkı bağlantı belirteçleri ZO-1 ve claudin 4'ün yer değiştirmesini ve oklüdin ve E-kadherinin içselleştirilmesini göstermiştir.
Kolon yongalarında 48 saatlik interferon gama stimülasyonunu takiben epitelyal parasellüler geçirgenlikte anlamlı bir artış gözlendi. Benzer şekilde, interferon gama, yarıklı Kaspaz 3'ün hücre içi içeriğindeki artışla gösterilen apoptozun aktivasyonunu indükler. İnterferon gama, VCAM-1 ve interlökin-6'nın bazolateral sekresyonu ve ICAM-1 ve serum amiloid proteininin apikal sekresyonu ile gösterildiği gibi kolon çipinde pro-inflamatuar moleküllerin polarize bir sekresyonunu indükledi.
Bağırsak çipinin başarılı bir şekilde kurulmasını takiben, bağırsak emilimi, taşınması ve metabolizması, besin seviyeleri ve bağırsak hormonu sekresyonu, konakçı mikrop patojen etkileşimleri, ilaç güvenliği ve etkinliği, hastaya özgü hastalık mekanizmaları ve tedavilere verilen yanıtları inceleyebiliriz.
