سيساعد هذا البروتوكول المستخدمين ويعلم الطلاب الخطوات الصحيحة في استخراج BMA و AEG و 2 و 4-DAB. وبالتالي تقليل فرص الخطأ وتحقيق نتائج متسقة. هذه الطريقة هي طريقة شائعة الاستخدام والتحقق من صحتها لاستخراج BMA وأيزومراته ، AEG و 2،4-DAB في مصفوفة بكتيرية للساونا.
يمكن استخدام هذه الطريقة لإجراء مزيد من الأبحاث المتعلقة بسمية BMAs وتوفير فهم أكبر حول BMA والآثار الصحية المرتبطة به. ابدأ بالطرد المركزي لعينة البكتيريا الزرقاء عند 3،500 جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. والتخلص من المادة الطافية في النفايات البيولوجية.
قم بتغطية أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على الحبيبات بفيلم مانع للتسرب واخترق بعض الثقوب في الفيلم باستخدام ملقط أنف طويل حاد. ثم قم بتخزين الأنبوب في وضع مستقيم عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد 30 دقيقة ، ضع الأنبوب في وضع مستقيم في وعاء زجاجي مجفف بالتجميد وضع الحاوية داخل الفريزر الذي تقل درجة حرارته عن 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للتبريد.
أخرج الحاوية الزجاجية من الثلاجة وأرفق الغطاء المطاطي. تأكد من أن المقبض الموجود على مخرج الصمام المطاطي لمجفف التجميد يشير إلى الأعلى ويتم تهويته إلى الغلاف الجوي. نعلق الحاوية الزجاجية بإحكام.
أدر مقبض مخرج الصمام المطاطي ببطء لتوجيهه في وضع لأسفل لتعريض الجرة للفراغ. واترك ما يصل إلى 24 ساعة من التجفيف بالتجميد لتسامي كل السائل. عند الانتهاء, وزن 15 إلى 50 ملليغرام من كريات العينات المجمدة في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر.
باستخدام ميزان تحليلي. أضف إلى العينة 300 إلى 600 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو الخليك المائي بنسبة 10٪ أو TCA. ضع أنابيب العينة في وعاء مملوء بالثلج المجروش.
امسح مسبار الصوتنة بمسح ورقي خال من النسالة تم رشه بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل غمر نهاية المسبار بالكامل في العينة والضغط على البدء. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع العينة التي تحتوي على أنبوب الطرد المركزي على الثلج لمدة دقيقة واحدة. وكرر عملية صوتنة لضمان تحلل الخلايا.
بعد تبريد العينة عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. أجهزة الطرد المركزي في 3،500 غرام لمدة 15 دقيقة في ثماني درجات مئوية. ثم باستخدام ماصة صغيرة ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر يسمى الكسر الحر.
أضف 400 ميكرولتر من TCA المائي بنسبة 10٪ إلى حبيبات العينة ، وقم بتفتيت الحبيبات إما عن طريق تحريك الدوامة أو بطرف الماصة الدقيقة. أجهزة الطرد المركزي ونقل المادة الطافية إلى نفس أنبوب الكسر الحر 2 ملليلتر. كرر هذه الخطوة مرة ثالثة باستخدام الأسيتون 10٪ TCA.
ضع أنبوب الكسر الحر مع فتح الغطاء في مبخر الطرد المركزي حتى تتم إزالة كل السائل المتطاير. بمجرد أن تصبح العينة خالية من السوائل المتطايرة ، قم بتغطية الأنبوب بإحكام بغشاء السقف واخترق الفيلم ببضع ثقوب باستخدام ملقط أنف طويل حاد. بعد التجفيف بالتجميد الذي تم توضيحه من قبل ، أعد تكوين العينة ب 200 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 20 مليمولار وضعها في مجمد ناقص 80 درجة مئوية.
أضف 400 ميكرولتر من الأسيتون بنسبة 100٪ إلى عينة الحبيبات باستخدام ماصة صغيرة وقم بتفتيت الحبيبات باستخدام تحريك الدوامة أو طرف الماصة الدقيقة. قم بنقل الحبيبات المغسولة والمعاد تعليقها كميا إلى قارورة الغلاف الزجاجي المقابلة. باستخدام ماصة صغيرة واحدة ملليلتر.
أضف 400 ميكرولتر أخرى من الأسيتون إلى أنبوب العينة للمساعدة في نقل الحبيبات المتبقية. قم بالطرد المركزي وصب السائل الطافي في النفايات البيولوجية قبل تجفيف الحبيبات في مبخر الطرد المركزي حتى تتم إزالة السائل وتجف الحبيبات. لتحضير ملف التحلل المائي الفراغي ، أضف ملليلترا واحدا من حمض الهيدروكلوريك المولي إلى أسفل ملف التحلل المائي.
أدخل بعناية قوارير الغلاف الموسومة مع العينات المجففة في ملف التحلل المائي باستخدام ملاقط تضمن وضعا مستقرا في وضع مستقيم. قم بتوصيل الغطاء بملف التحلل المائي وادفع المقبض الأحمر على الغطاء لإغلاق الصمام. بعد تشغيل مضخة التفريغ ، قم بتوصيل الأنبوب المفرغ برأس غطاء ملف التحلل المائي واضغط على المقبض الأخضر على الغطاء لفتح الصمام.
بعد ذلك ، اسمح لمضخة التفريغ بإزالة الهواء من القارورة لمدة دقيقة واحدة. ثم أغلق القارورة عن طريق الضغط على المقبض الأحمر على غطاء قارورة التحلل المائي. قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ وإزالة الأنبوب المفرغ.
قم بتوصيل أنبوب مطاطي بصنبور غاز النيتروجين على طاولة المختبر. وافتح الصنبور قليلا. ضع الإبهام في نهاية الأنبوب ، وأغلقه وعد حتى يبدأ الغاز في الهروب مع تراكم الضغط.
بعد ذلك ، قم بتوصيل الطرف الآخر من الأنبوب المطاطي برأس غطاء قارورة التحلل المائي. وادفع على الفور المقبض الأخضر للغطاء. احسب الزمن المستغرق لتسرب الغاز.
ادفع المقبض الأحمر بسرعة على الغطاء وأزل الأنبوب المطاطي. كرر عملية المعالجة الفراغية بأكملها مرتين. التأكد من خلو قارورة التحلل المائي الزجاجية من الهواء ومليئة بغاز النيتروجين.
ضع قارورة التحلل المائي في فرن مسخن مسبقا على حرارة 110 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة. باستخدام قفازات الفرن ، قم بإزالة قارورة التحلل المائي الزجاجية من الفرن. اترك القارورة لتبرد داخل غطاء الدخان لمدة 10 دقائق قبل دفع المقبض الأخضر أثناء مواجهته بعيدا لتحرير الضغط والغاز.
أعد تكوين كريات العينة المتحللة بالماء مع 200 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 20 المولي في قارورة القشرة وأعد تعليق الحبيبات. أجهزة الطرد المركزي قوارير قذيفة تحتوي على كريات العينة المعاد تشكيلها لمدة دقيقتين عند 5, 300 G و 25 درجة مئوية. انقل عينات الكسر الحر المعاد تشكيلها وجزء البروتين إلى أنبوبي الترشيح المليلتر اللذين يحتويان على مرشحات غشاء المسام 0.2 ميكرون والمسمى بالكسر الحر وجزء البروتين.
ضع أنابيب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 5،000 جم و 25 درجة مئوية. يظهر هنا كروماتوجرام مراقبة التفاعل المتعدد لمعيار يحتوي على beta-Methylamino-L-alanine أو BMAA وأيزومراته المشار إليها بالخطوط المشفرة بالألوان. لوحظ اكتشاف إيجابي لجميع الأيزومرات الثلاثة ، BMAA و DAB و AEG في الجزء الحر من أنواع Merismopedia التي تم جمعها من بحيرة ليدل.
في حين أن الجزء المرتبط من أنواع Microcystis flos-aquae التي تم جمعها من Waka Waterworks يوضح نتيجة سلبية ل BMAA وأيزومراته. يجب نقل الحبيبات المعاد تعليقها كميا إلى قارورة القشرة المقابلة للسماح بنقطة تطبيع دقيقة بناء على كتلة البكتيريا الزرقاء. ينصح المرضى والعناية الواجبة أثناء تنفيذ هذه الخطوة.
باتباع هذا الإجراء. يجب أن تخضع الكسور المستخرجة لخطوة تنشيط للسماح بالمرحلة العكسية. اللوني السائل ، تحليل مطياف الكتلة جنبا إلى جنب.
تطبيق هذه التقنية يوسع المجالات العلمية المختلفة. بما في ذلك العلوم البيئية من خلال تحليل السموم cynotoxins في العينات البيئية. ومجالات مثل علم السموم والكيمياء الحيوية من خلال التحقيق في نظرية الدمج الخاطئ ل BMA.
