Ce protocole aidera les utilisateurs et enseignera aux étudiants les étapes correctes dans l’extraction de BMA, AEG et 2, 4-DAB. Minimisant ainsi les risques d’erreur et produisant des résultats cohérents. Cette méthode est une méthode couramment utilisée et validée pour l’extraction de BMA et de ses isomères, AEG et 2, 4-DAB dans une matrice bactérienne de sauna.
Cette méthode peut être utilisée pour approfondir la recherche sur la toxicité des BMA et fournir une meilleure compréhension de la BMA et de ses effets connexes sur la santé. Commencer par centrifusion de l’échantillon de cyanobactéries à 3 500 g pendant 10 minutes à 25 degrés Celsius. Et jeter le surnageant dans les déchets biologiques.
Couvrir le tube de centrifugation contenant la pastille avec un film d’étanchéité et percer quelques trous dans le film à l’aide d’une pince à épiler à nez longue et tranchante. Rangez ensuite le tube à la verticale à moins 80 degrés Celsius. Après 30 minutes, placez le tube à la verticale dans un récipient en verre lyophilisateur et placez le récipient à l’intérieur du congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant cinq minutes pour le refroidissement.
Retirez le récipient en verre du congélateur et fixez le couvercle en caoutchouc. Assurez-vous que la poignée de la sortie de la valve en caoutchouc du lyophilisateur est dirigée vers le haut et ventilée dans l’atmosphère. Fixez fermement le récipient en verre.
Tournez lentement la poignée de la sortie de la valve en caoutchouc pour la pointer en position vers le bas afin d’exposer le pot au vide. Et permettre jusqu’à 24 heures de lyophilisation pour sublimer tout le liquide. Lorsque vous avez terminé, pesez de 15 à 50 milligrammes de granulés d’échantillon congelés dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.
Utilisation d’une balance analytique. À l’échantillon, ajouter 300 à 600 microlitres d’acide trichloracétique ou TCA aqueux à 10%. Placez les tubes d’échantillon dans un récipient rempli de glace pilée.
Essuyez la sonde du sonicateur avec une lingette en papier non pelucheuse pulvérisée avec de l’éthanol à 70% avant d’immerger complètement l’extrémité de la sonde dans l’échantillon et d’appuyer sur start. Une fois cela fait, placez l’échantillon contenant le tube centrifuge sur de la glace pendant une minute. Et répétez le processus de sonication pour assurer la lyse cellulaire.
Après refroidissement de l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant 24 heures. Centrifuger à 3 500 g pendant 15 minutes à huit degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette, transférer le surnageant dans un tube de deux millilitres étiqueté fraction libre.
Ajouter 400 microlitres de TCA aqueux à 10% dans la pastille de l’échantillon et briser la pastille soit par agitation vortex, soit avec l’embout de la micro-pipette. Centrifuger et transférer le surnageant dans le même tube de fraction libre de deux millilitres. Répétez cette étape une troisième fois en utilisant de l’acétone 10% TCA.
Placez le tube de fraction libre avec le couvercle ouvert dans un évaporateur centrifuge jusqu’à ce que tout le liquide volatil soit éliminé. Une fois que l’échantillon est exempt de liquides volatils, couvrez solidement le tube avec le film de plafond et percez le film avec quelques trous à l’aide d’une pince à épiler à nez longue et tranchante. Après lyophilisation démontrée précédemment, reconstituez l’échantillon avec 200 microlitres d’acide chlorhydrique 20 millimolaires et placez-le dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.
Ajouter 400 microlitres d’acétone à 100% sur la pastille de l’échantillon à l’aide d’une micropipette et briser la pastille en utilisant soit l’agitation vortex, soit l’embout de la micro-pipette. Transférer quantitativement la pastille lavée et remise en suspension dans le flacon de coque en verre correspondant. À l’aide d’une micropipette d’un millilitre.
Ajouter 400 microlitres supplémentaires d’acétone dans le tube à échantillon pour aider à transférer la pastille restante. Centrifuger et décanter le liquide surnageant en déchets biologiques avant de sécher la pastille dans un évaporateur centrifuge jusqu’à ce que le liquide soit retiré et que le granulé soit sec. Pour préparer le fichier d’hydrolyse sous vide, ajoutez un millilitre d’acide chlorhydrique à six molaires au fond du fichier d’hydrolyse.
Insérez soigneusement les flacons d’enveloppe étiquetés avec des échantillons séchés dans le fichier d’hydrolyse à l’aide d’une pince à épiler assurant une position stable à la verticale. Fixez le couvercle à la lime d’hydrolyse et poussez le bouton rouge sur le couvercle pour fermer la vanne. Après avoir allumé la pompe à vide, fixez le tube à vide à la tête du couvercle de la lime d’hydrolyse et appuyez sur le bouton vert du couvercle pour ouvrir la vanne.
Ensuite, laissez la pompe à vide retirer l’air du flacon pendant une minute. Fermez ensuite le flacon en appuyant sur le bouton rouge du couvercle du flacon d’hydrolyse. Éteignez la pompe à vide et retirez le tube à vide.
Fixez un tube en caoutchouc au robinet d’azote gazeux sur la paillasse du laboratoire. Et ouvrez légèrement le robinet. Placez le pouce à l’extrémité du tube, scellez-le et comptez jusqu’à ce que le gaz commence à s’échapper à mesure que la pression augmente.
Ensuite, fixez l’autre extrémité du tube en caoutchouc à la tête du couvercle du flacon d’hydrolyse. Et appuyez immédiatement sur le bouton vert du couvercle. Comptez le temps nécessaire pour que le gaz s’échappe.
Poussez rapidement le bouton rouge sur le couvercle et retirez le tube en caoutchouc. Répétez l’ensemble du processus de traitement sous vide deux fois. S’assurer que le flacon d’hydrolyse du verre est exempt d’air et rempli d’azote gazeux.
Placez le flacon d’hydrolyse dans un four préchauffé réglé à 110 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. À l’aide de gants de four, retirez le flacon d’hydrolyse de verre du four. Laissez le flacon refroidir à l’intérieur de la hotte pendant 10 minutes avant de pousser le bouton vert tout en lui faisant face pour libérer la pression et le gaz.
Reconstituer les pastilles d’échantillon hydrolysées avec 200 microlitres d’acide chlorhydrique molaire 20 dans le flacon d’enveloppe et remettre les pastilles en suspension. Centrifuger les flacons d’enveloppe contenant les pastilles d’échantillon reconstituées pendant deux minutes à 5, 300 G et 25 degrés Celsius. Transférer les échantillons de fraction libre reconstituée et la fraction protéique dans les tubes filtrants de deux millilitres contenant des filtres à membrane poreuse de 0,2 micron et étiquetés comme fraction libre et fraction protéique.
Placez les tubes pour centrifugation pendant 30 minutes à 5 000 g et 25 degrés Celsius. Le chromatogramme de surveillance des réactions multiples d’un étalon contenant de la bêta-méthylamino-L-alanine ou BMAA et ses isomères indiqués par les lignes codées par couleur est illustré ici. Une détection positive pour les trois isomères, BMAA, DAB et AEG, a été observée dans la fraction libre des espèces Merismopedia prélevées dans le lac Liddel.
Alors que la fraction liée des espèces Microcystis flos-aquae collectées à Waka Waterworks a montré un résultat négatif pour BMAA et ses isomères. La pastille remise en suspension doit être transférée quantitativement dans le flacon d’enveloppe correspondant pour permettre un point de normalisation précis basé sur la masse des cyanobactéries. Les patients et la diligence raisonnable sont conseillés lors de l’exécution de cette étape.
Suivez cette procédure. Les fractions extraites devront subir une étape de dévitalisation pour permettre une phase inverse. Chromatographie liquide, analyse par spectrométrie de masse en tandem.
L’application de cette technique élargit divers domaines scientifiques. Y compris les sciences de l’environnement par l’analyse des cynotoxines dans les échantillons environnementaux. Et des domaines tels que la toxicologie et la biochimie à travers l’étude de la théorie de la mauvaise incorporation de BMA.
