פרוטוקול זה יסייע למשתמשים וילמד את התלמידים את השלבים הנכונים בחילוץ BMA, AEG ו- 2, 4-DAB. ובכך למזער את הסיכויים לטעות ולהפיק תוצאות עקביות. שיטה זו היא שיטה נפוצה ומאומתת למיצוי BMA והאיזומרים שלו, AEG ו-2, 4-DAB במטריצת חיידקי סאונה.
ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקדם מחקר בנוגע לרעילות של BMAs ולספק הבנה טובה יותר לגבי BMA וההשפעות הבריאותיות הקשורות אליו. התחל על ידי centrifusion דגימת ציאנובקטריה ב 3, 500 גרם במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. והשלכת הסופר-נטנט לפסולת ביולוגית.
מכסים את צינור הצנטריפוגה המכיל את הכדור בסרט איטום וחודרים כמה חורים בסרט באמצעות פינצב אף ארוך וחד. לאחר מכן לאחסן את הצינור זקוף במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, הכניסו את השפופרת זקופה למיכל זכוכית של מייבש כביסה והניחו את המיכל בתוך מקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לקירור.
מוציאים את מיכל הזכוכית מהמקפיא ומחברים את מכסה הגומי. ודאו שהידית בשקע שסתום הגומי של מייבש ההקפאה מכוונת כלפי מעלה ומאווררת לאטמוספרה. חבר את מיכל הזכוכית בחוזקה.
סובבו באיטיות את הידית של שקע שסתום הגומי כדי לכוון אותה למצב מטה כדי לחשוף את הצנצנת לוואקום. ולאפשר עד 24 שעות של ייבוש בהקפאה כדי סובלימציה של כל הנוזלים. בסיום, שקלו 15 עד 50 מיליגרם של כדורי דגימה קפואים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.
שימוש באיזון אנליטי. לדגימה, הוסף 300 עד 600 מיקרוליטרים של 10% חומצה טריכלורואצטית מימית או TCA. מניחים את צינורות הדגימה במיכל מלא בקרח כתוש.
נגבו את הבדיקה של סוניקטור עם מגבון נייר ללא מוך שרוסס ב-70% אתנול לפני טבילה מלאה של קצה הבדיקה לתוך הדגימה ולחיצה על התחלה. לאחר שתסיים, הנח את הדגימה המכילה את צינור הצנטריפוגה על קרח למשך דקה אחת. וחזור על תהליך הסוניקציה כדי להבטיח תזה של תאים.
לאחר קירור הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. צנטריפוגה ב 3, 500 גרם במשך 15 דקות בשמונה מעלות צלזיוס. לאחר מכן באמצעות מיקרו פיפטה, להעביר את supernatant לצינור שני מיליליטר שכותרתו שבר חופשי.
הוסף 400 מיקרוליטרים של 10% TCA מימי לתוך גלולת הדגימה, ופרק את הכדור על ידי תסיסה מערבולת או עם קצה מיקרו פיפטה. צנטריפוגה ולהעביר את supernatant לתוך אותו צינור שני מיליליטר שברים חינם. חזור על שלב זה בפעם השלישית באמצעות 10% אצטון TCA.
מניחים את צינור השבר החופשי כשהמכסה פתוח לתוך מאייד צנטריפוגלי עד שכל הנוזל הנדיף מוסר. לאחר שהדגימה נקייה מנוזלים נדיפים, מכסים את הצינור היטב עם סרט התקרה וחודרים את הסרט בכמה חורים באמצעות פינצב אף ארוך וחד. לאחר ייבוש בהקפאה שהוכח קודם לכן, לשחזר את הדגימה עם 200 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית 20 מילימולר ולהניח אותו במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס.
הוסף 400 מיקרוליטרים של 100% אצטון על כדור הדגימה באמצעות מיקרו פיפטה ופרק את הכדור באמצעות תסיסה מערבולת או קצה מיקרו פיפטה. מעבירים באופן כמותי את הכדור השטוף והמוחזר לבקבוקון קליפת הזכוכית המתאים. באמצעות מיקרו פיפטה של מיליליטר אחד.
הוסיפו עוד 400 מיקרוליטרים של אצטון לצינור הדגימה כדי לסייע בהעברת הכדור הנותר. צנטריפוגה ודקירה את נוזל העל לפסולת ביולוגית לפני ייבוש הכדור במאייד צנטריפוגלי עד להוצאת הנוזל והתייבשותו. כדי להכין את קובץ הידרוליזה ואקום להוסיף מיליליטר אחד של שש חומצה הידרוכלורית טוחנת לתחתית קובץ הידרוליזה.
הכנס בזהירות את בקבוקוני המעטפת המסומנים עם דגימות מיובשות לקובץ ההידרוליזה באמצעות פינצטה המבטיחה מיקום יציב זקוף. חברו את המכסה לקובץ ההידרוליזה ולחצו על הידית האדומה של המכסה כדי לסגור את השסתום. לאחר הפעלת משאבת הוואקום, חבר את שפופרת הוואקום לראש מכסה קובץ ההידרוליזה ולחץ על הידית הירוקה במכסה כדי לפתוח את השסתום.
לאחר מכן, אפשרו למשאבת הוואקום להוציא את האוויר מהבקבוקון למשך דקה אחת. לאחר מכן סגור את הבקבוקון על ידי לחיצה על הידית האדומה על מכסה בקבוקון הידרוליזה. כבה את משאבת הוואקום והסר את שפופרת הוואקום.
חברו צינור גומי לברז גז החנקן על ספסל המעבדה. ופתחו מעט את הברז. מניחים את האגודל בקצה הצינור, אוטמים אותו וסופרים עד שהגז מתחיל לברוח כשהלחץ מצטבר.
לאחר מכן, חבר את הקצה השני של צינור הגומי לראש מכסה בקבוקון הידרוליזה. ומיד לדחוף את הידית הירוקה של המכסה. ספרו את הזמן שלוקח לגז לברוח.
לחץ במהירות את הידית האדומה על המכסה והסר את צינור הגומי. חזור על כל תהליך הטיפול בוואקום פעמיים. הקפדה על בקבוקון ההידרוליזה מזכוכית נקי מאוויר ומלא בגז חנקן.
הכניסו את בקבוקון ההידרוליזה לתנור שחומם מראש בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות. בעזרת כפפות תנור, מוציאים את בקבוקון ההידרוליזה מהתנור. הניחו לבקבוקון להתקרר בתוך מכסה האדים למשך 10 דקות לפני שתדחפו את הידית הירוקה כשפניכם הרחק ממנה כדי לשחרר לחץ וגז.
שחזרו את כדורי הדגימה שעברו הידרוליזה עם 200 מיקרוליטרים של 20 חומצה הידרוכלורית טוחנת לתוך בקבוקון הקליפה והניחו מחדש את הכדור. צנטריפוגה של בקבוקוני הקונכייה המכילים את כדורי הדגימה המשוחזרים במשך שתי דקות ב 5, 300 G ו 25 מעלות צלזיוס. העבר את דגימות השבר החופשי ושבר החלבון המשוחזרים לשני צינורות מסנן מיליליטר המכילים מסנני קרום נקבוביות של 0.2 מיקרון ומסומנים כשבר חופשי ושבר חלבון.
מניחים את הצינורות לצנטריפוגה למשך 30 דקות ב 5, 000 G ו 25 מעלות צלזיוס. כרומטוגרמה לניטור תגובות מרובות של תקן המכיל בטא-מתילאמינו-L-אלנין או BMAA והאיזומרים שלו המסומנים על ידי הקווים המקודדים בצבע מוצגת כאן. זיהוי חיובי של כל שלושת האיזומרים, BMAA, DAB ו-AEG נצפה בחלק החופשי של מיני ה-Merismopedia שנאספו מאגם לידל.
ואילו החלק המאוגד של המין Microcystis flos-aquae שנאסף מ-Waka Waterworks המחיש תוצאה שלילית עבור BMAA והאיזומרים שלו. יש להעביר את הכדור המחודש באופן כמותי לתוך בקבוקון המעטפת המתאים כדי לאפשר נקודת נורמליזציה מדויקת המבוססת על מסת ציאנובקטריה. מומלץ למטופלים ולבדיקות נאותות בעת ביצוע שלב זה.
בעקבות הליך זה. השברים המופקים יצטרכו לעבור שלב דה-ויטאליזציה כדי לאפשר פאזה הפוכה. כרומטוגרפיה נוזלית, ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם.
היישום של טכניקה זו מרחיב תחומים מדעיים שונים. כולל מדעי הסביבה באמצעות ניתוח של cynotoxins בדגימות סביבתיות. ותחומים כמו טוקסיקולוגיה וביוכימיה באמצעות חקירת תיאוריית ה-Misincorporation של BMA.
