هذا البروتوكول مهم لأنه سمح لنا بتحديد ما إذا كانت عينة المريض تحتوي على أجسام مضادة مسببة للأمراض. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على التمييز بين التفاعل بين المستضدات السطحية وداخل الخلايا ، والتي لا يمكن تمييزها بسهولة بطرق أخرى. تستخدم الخلايا العصبية الثقافية للحصين لتحديد الأجسام المضادة الجديدة.
يسمح تحديد هذه الأجسام المضادة الجديدة في نهاية المطاف ببدء علاج معين في العلاجات الأحادية لتحسين نتائج المرضى. هذه التقنية مهمة لأنه يمكن توسيعها لتشمل المجال الكامل للأمراض المتعلقة بالأجسام المضادة المسببة للأمراض الموجهة إلى بروتينات السطح العصبي. عقد رأس الجنين مع ملقط منحني ناعم ، يخترق المدارات مع زوج من الملقط المستقيم الدقيق بزاوية 45 درجة.
ثم حرر الملقط المنحني الناعم. بمساعدة مقص الجراحة ، قم بتشريح الجلد والجمجمة بدءا من العظم القذالي إلى العظم الجبهي. ثم قم بإزالة الدماغ بزوج من الملقط المنحني الناعم وقم بجمعه في طبق ستة سنتيمترات مع السبات بالإضافة إلى B27.
بمجرد استعادة الأدمغة من جميع الأجنة ، استخدم الملقط المستقيم الناعم لفصل telencephalons بشكل مهجي. بعد ذلك ، قم بإعداد طبق 10 سم عن طريق وضع قطرات من السبات بالإضافة إلى B27 على مسافات سنتيمتر واحد في دائرة ، ووضع تيلسيفالون واحد لكل قطرة للتصور من خلال نطاق التشريح عند تكبير 1.25 X. أثناء العمل تحت المجهر ، قم بإزالة المهاد بعناية ، وقشر السحايا لتصور الحصين بشكل أفضل.
ثم تشريح الحصين مع مقص الربيع الدقيق. وضعه في طبق 3.5 سم مع السبات زائد B27 و istrate اثنين. كرر الإجراء لجمع كل الحصين.
للتفكك الأنزيمي للحصين ، أضف ملليلتر واحد من 2.5٪ من التربسين في أنبوب 50 ملليلتر الذي يحتوي على الحصين. بعد رفع الحجم في الأنبوب إلى خمسة ملليلتر باستخدام HBSS ، احتضن الأنبوب لمدة 15 دقيقة في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية. لمزيد من تخفيف التربسين ، أضف 10 ملليلتر من HBSS المسخن مسبقا ، وضع الأنبوب مرة أخرى في الحمام المائي ، المحدد على 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، استخدم ماصة صغيرة سعة 1000 ميكرولتر لنقل الحصين الذي يظهر ككتلة مخاطية إلى أنبوب 50 ملليلتر. واحتضن الأنسجة بستة ملليلترات من HBSS المسخن مسبقا لمدة خمس دقائق ، كما هو موضح. لفصل الأنسجة ميكانيكيا ، انقل كتلة الحصين إلى أنبوب ملليلتر مع قاع مخروطي.
بعد إضافة ملليلتر واحد من وسائط DMEM المسخنة مسبقا ، قم بتجانس الكريات باستخدام ماصة صغيرة سعة 1000 ميكرولتر عن طريق الشفط بلطف لأعلى ولأسفل. لضمان عدم إنشاء فقاعات ، كرر الشفط لأعلى ولأسفل من 10 إلى 20 مرة باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة مسبقا مع طرفها على اتصال مع الجزء السفلي المخروطي من الأنبوب حتى يصبح الخليط شفافا. عد الخلايا قبل توزيعها بالتساوي على طبق 3.5 سم مع حركات اهتزاز متقاطعة.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، ضع الطبق في الحاضنة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. للتلطيخ المناعي الفلوري لمدة 14 يوما في الخلايا المختبرية ، أضف العينة التي تحتوي على أجسام مضادة مضادة ل NMDAR إلى زلات الغطاء واحتضنها عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد ساعة واحدة ، عالج العينة باستخدام 4٪ من الفورمالديهايد و PBS كحل تثبيت في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
ثم اغسل دفعة العينة باستخدام PBS لمدة خمس دقائق لكل منها ، تليها إضافة الماعز المضاد الثانوي المضاد للإنسان Alexa Fluor 488 عند تخفيف واحد إلى 1000 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتركيب زلات الغطاء التي تحتوي على العينة بوسط تركيب سائل واستنشق أي سائل متبقي. تصور الخلايا العصبية مع التصوير الفلوري.
لتصوير الكالسيوم، استخدم 14 إلى 18 يوما في الخلايا المختبرية التي نمت على زلات الغطاء. قبل التصوير ، عالج الخلايا باستخدام ترميز الناقل الفيروسي ل pAAV2 CAG GCaMP 5G في 2.5 مرة 10 إلى نسخ الجينوم العاشرة لكل ملليلتر لمدة خمسة إلى سبعة أيام. قبل يوم واحد من التصوير ، احتضن الخلايا مع عينة المريض لمدة 24 ساعة.
في يوم التصوير ، قم بإعداد الإعداد واضبط غرفة خلية المجهر على 37 درجة مئوية. املأ الممر بالماء المقطر ، وقم بغرسه بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ للحفاظ على الظروف الفسيولوجية للخلايا. بعد تغطية الخلايا بمحلول فسيولوجي خارج الخلية ، قم بنقلها إلى غرفة خلية المجهر.
أضف 10 ميكرومولار NBQX لمنع مستقبلات AMPA و KA ، وتصور استجابة مستقبلات NMDA. احصل على فيلم مدته أربع دقائق مع الإطارات المسجلة كل 100 مللي ثانية. بعد فترة وجيزة من بدء الاستحواذ ، أضف محلول التحفيز إلى الطبق.
عند التحفيز ، قم باستخراج إشارة الفلورسنت بمرور الوقت من المستنبتات المحتضنة مع التحكم وعينات السائل الشوكي الدماغي للمريض أو CSF باستخدام برامج المعالجة مثل Image J.It لوحظ أن الخلايا في يوم واحد في المختبر كانت موزعة بالتساوي والتزمت بالصفيحة مع تطور صفيحة حول جسم الخلية وبدأت الخلايا العصبية البسيطة في التمدد. بعد بضعة أيام في الثقافة ، امتدت الخلايا العصبية لمسافة قصيرة وأظهرت الخلايا استقطابا كبيرا. استمرت الشبكة العصبية في النمو وأصبحت معقدة.
في 18 يوما ، كانت الخلايا العصبية ناضجة ومترابطة وبنت الشبكة العصبية. تظهر صور الفلورسنت التمثيلية الخلايا العصبية الناضجة في 18 يوما باستخدام علامات انتقائية. أنتجت حضانة الثقافات مع عينات المرضى إشارة فلورية مكثفة لأنها تحتوي على الأجسام المضادة التلقائية التي تعرفت على مستقبلات NMDA الموجودة على سطح الخلايا العصبية.
في المقابل ، لم تنتج عينات التحكم أي إشارة فلورسنت عند إعطائها للثقافات العصبية. زاد تطبيق NMDA من شدة التألق كما هو موضح في تغير في التألق الأخضر داخل الخلايا. عندما تم تطبيق المحفز ، أظهرت الخلايا العصبية المعالجة بعينة السائل الدماغي الشوكي الضابطة فرقا أعلى في كثافة التألق من الخلايا المعالجة بعينة السائل الدماغي الشوكي للمرضى.
يحدد تحديد الملكية وتشريح الحصين نقاء الثقافات. الخلية هي التجميع هو عامل رئيسي ، خاصة عند استخدام الثقافات لأغراض التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الخلايا العصبية الحصينية المستزرعة لتحديد الأجسام المضادة الجديدة ومستضداتها المستهدفة عند دمجها مع تقنيات الترسيب المناعي وقياس الطيف الكتلي.
وقد سمحت هذه التقنية بتوصيف فئة جديدة من الأمراض بوساطة الأجسام المضادة. لذلك ، من الضروري في دراسة المجال الجديد لعلم المناعة النانوي.
