Este protocolo é significativo porque nos permitiu identificar se uma amostra de paciente continha anticorpos patogênicos. A principal vantagem dessa técnica reside em sua capacidade de diferenciar a reatividade entre antígenos superficiais e intracelulares, que não podem ser facilmente discriminados por outros métodos. Os neurônios hipocampais culturais são usados para identificar novos anticorpos.
A identificação desses novos anticorpos eventualmente permite o início de um específico em monoterápicos para melhorar os resultados dos pacientes. Essa técnica é importante porque pode ser estendida a todo o campo das doenças relacionadas a anticorpos patogênicos direcionados às proteínas da superfície neuronal. Segurando a cabeça do embrião com fórceps curvados finos, perfure as órbitas com um par de fórceps retos finos em um ângulo de 45 graus.
Em seguida, solte os fórceps curvados finos. Com a ajuda da tesoura de cirurgia, disseca a pele e o crânio desde o osso occipital até o osso frontal. Em seguida, remova o cérebro com um par de fórceps finos curvados e colete-o no prato de seis centímetros com hibernação mais B27.
Uma vez que os cérebros de todos os embriões são recuperados, use os fórceps retos finos para separar os telencephalons. Em seguida, prepare um prato de 10 centímetros colocando gotas de hibernação mais B27 a uma distância de um centímetro em um círculo, e coloque um telencephalon por gota para visualizar através do escopo de dissecação em uma ampliação de 1,25 X. Enquanto trabalha sob o microscópio, remova cuidadosamente o tálamo, e descasque as meninges para melhor visualizar o hipocampo.
Em seguida, dissecar o hipocampo com a tesoura de mola de precisão. E coloque-o no prato de 3,5 centímetros com hibernar mais B27 e istrar dois. Repita o procedimento para coletar todo o hipocampi.
Para a dissociação enzimática do hipocampo, adicione um mililitro de 2,5% de trippsina no tubo de 50 mililitros contendo o hipocampi. Depois de levar o volume no tubo para cinco mililitros com HBSS, incubar o tubo por 15 minutos no banho de água a 37 graus Celsius. Para diluir ainda mais a trippsina, adicione 10 mililitros de HBSS pré-aquecidos e coloque o tubo de volta no banho de água, ajustado a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, use uma micro pipeta de 1000 microliter para transferir o hipocampi aparecendo como uma massa de muco para um tubo de 50 mililitros. E incubar o tecido com seis mililitros de HBSS pré-aquecidos por cinco minutos, como demonstrado. Para dissociar o tecido mecanicamente, transfira a massa hipocampal para um tubo de dois mililitros com fundo cônico.
Depois de adicionar um mililitro de mídia DMEM pré-aquecido, homogeneize a pelota com uma micro pipeta de 1000 microliter aspirando suavemente para cima e para baixo. Garantindo não criar bolhas, repita a aspiração para cima e para baixo 10 a 20 vezes com uma pipeta de vidro pré-puxada com sua ponta em contato com o fundo cônico do tubo até que a mistura fique translúcida. Conte as células antes de distribuí-las uniformemente em um prato de 3,5 centímetros com movimentos de agitação cruzados.
Uma vez feito, coloque o prato na incubadora com 5% de dióxido de carbono. Para imunossuperas fluorescentes de 14 dias em células in vitro, adicione a amostra contendo anticorpos Anti-NMDAR aos deslizamentos de cobertura e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após uma hora, trate a amostra com 4% de formaldeído e PBS como solução de fixação à temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, lave o impulso amostral com PBS por cinco minutos cada, seguido pela adição de anticorpos secundários anti-humanos Alexa Fluor 488 em uma a 1000 diluição por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, monte os deslizamentos de cobertura contendo a amostra com um meio de montagem líquida e aspire qualquer líquido restante. Visualize os neurônios com imagens de fluorescência.
Para a imagem de cálcio, use de 14 a 18 dias em células in vitro que foram cultivadas em deslizamentos de cobertura. Antes da imagem, trate as células com a codificação vetorial viral para pAAV2 CAG GCaMP 5G a 2,5 vezes 10 a 10 vezes o 10º genoma por mililitro por cinco a sete dias. Um dia antes da imagem, incubar as células com a amostra do paciente por 24 horas.
No dia da imagem, prepare a configuração e coloque a câmara celular do microscópio em 37 graus Celsius. Encha a pista com água destilada, infunda-a com 5% de dióxido de carbono para manter as condições fisiológicas celulares. Depois de cobrir as células com solução fisiológica extracelular, transfira-as para a câmara celular do microscópio.
Adicione 10 micromolarS NBQX para bloquear os receptores AMPA e KA, e visualize a resposta do receptor NMDA. Adquira o filme de quatro minutos com os quadros gravados a cada 100 milissegundos. Logo após o início da aquisição, adicione a solução de estimulação ao prato.
Após a estimulação, extraia o sinal fluorescente ao longo do tempo a partir do incubado da cultura com o controle e amostras de fluido espinhal cerebral ou CSF do paciente usando softwares de processamento como Image J.It foi observado que as células em um dia in vitro foram distribuídas uniformemente e aderiram à placa com uma lamella se desenvolvendo ao redor do corpo celular e neurites menores começando a se estender. Após alguns dias na cultura, os neurites se estenderam a uma curta distância e as células apresentaram uma polarização significativa. A rede neuronal continuou crescendo e tornou-se complexa.
Aos 18 dias, os neurônios estavam maduros, interligados e construíram a rede neuronal. As imagens fluorescentes representativas mostram neurônios maduros aos 18 dias usando marcadores seletivos. A incubação das culturas com as amostras do paciente produziu um intenso sinal de fluorescência, pois contém os anticorpos automáticos que reconheceram o receptor NMDA presente na superfície dos neurônios.
Em contraste, as amostras de controle não produziram sinal fluorescente quando administradas às culturas neuronais. A aplicação do NMDA aumentou a intensidade da fluorescência, como indicado por uma mudança na fluorescência verde intracelular. Quando o estimulador foi aplicado, os neurônios tratados com a amostra de CSF de controle apresentaram maior diferença na intensidade da fluorescência do que as células tratadas com a amostra de CSF dos pacientes.
A identificação e dissecção da propriedade do hipocampo determinam a pureza das culturas. A agregação celular é um fator-chave, especialmente quando se usa as culturas para fins de imagem. Além disso, neurônios hipocampais cultivados podem ser usados para identificar novos anticorpos e seus antígenos-alvo quando combinados com técnicas de imunoprecipitação e espectrometria de massa.
Essa técnica permitiu a caracterização de uma nova categoria de doenças mediadas por anticorpos. Portanto, é essencial no estudo do novo campo da nano imunologia.
