Ce protocole est important car il nous a permis d’identifier si un échantillon de patient contenait des anticorps pathogènes. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à différencier la réactivité entre les antigènes de surface et intracellulaires, qui ne peuvent pas être facilement discriminés par d’autres méthodes. Les neurones culturels de l’hippocampe sont utilisés pour identifier de nouveaux anticorps.
L’identification de ces nouveaux anticorps permet éventuellement l’initiation d’un anticorps spécifique en monothérapie pour améliorer les résultats pour les patients. Cette technique est importante car elle peut être étendue à l’ensemble du domaine des maladies liées aux anticorps pathogènes dirigés contre les protéines de surface neuronales. En tenant la tête de l’embryon avec de fines pinces incurvées, percez les orbites avec une paire de pinces droites fines à un angle de 45 degrés.
Relâchez ensuite les fines pinces incurvées. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, disséquez la peau et le crâne en partant de l’os occipital jusqu’à l’os frontal. Ensuite, retirez le cerveau avec une paire de pinces fines incurvées et recueillez-le dans la boîte de six centimètres avec hibernate plus B27.
Une fois que les cerveaux de tous les embryons sont récupérés, utilisez la fine pince droite pour séparer sagittiquement les télencéphales. Ensuite, préparez une boîte de 10 centimètres en plaçant des gouttes d’hibernate plus B27 à une distance d’un centimètre dans un cercle, et placez un télencéphale par goutte pour visualiser à travers la lunette de dissection à un grossissement de 1,25 X. Tout en travaillant au microscope, retirez soigneusement le thalamus et pelez les méninges pour mieux visualiser l’hippocampe.
Ensuite, disséquez l’hippocampe avec les ciseaux à ressort de précision. Et placez-le dans le plat de 3,5 centimètres avec hibernate plus B27 et istrate deux. Répétez la procédure pour collecter tous les hippocampes.
Pour la dissociation enzymatique de l’hippocampe, ajouter un millilitre de trypsine à 2,5% dans le tube de 50 millilitres contenant l’hippocampe. Après avoir porté le volume du tube à cinq millilitres avec HBSS, incuber le tube pendant 15 minutes au bain-marie à 37 degrés Celsius. Pour diluer davantage la trypsine, ajoutez 10 millilitres de HBSS préchauffé et replacez le tube dans le bain-marie, réglé à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, utilisez une micro-pipette de 1000 microlitres pour transférer l’hippocampe apparaissant sous forme de masse de mucus dans un tube de 50 millilitres. Et incuber le tissu avec six millilitres de HBSS préchauffé pendant cinq minutes, comme démontré. Pour dissocier mécaniquement le tissu, transférer la masse de l’hippocampe dans un tube de deux millilitres à fond conique.
Après avoir ajouté un millilitre de média DMEM préchauffé, homogénéiser la pastille avec une micro-pipette de 1000 microlitres en aspirant doucement de haut en bas. En veillant à ne pas créer de bulles, répétez l’aspiration de haut en bas 10 à 20 fois avec une pipette en verre pré-tirée avec son embout en contact avec le fond conique du tube jusqu’à ce que le mélange soit translucide. Comptez les cellules avant de les répartir uniformément sur une boîte de 3,5 centimètres avec des mouvements de secousses croisés.
Une fois cela fait, placez le plat dans l’incubateur avec 5% de dioxyde de carbone. Pour une immunocoloration fluorescente de 14 jours in vitro de cellules, ajouter l’échantillon contenant des anticorps anti-NMDAR aux lames de couvercle et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après une heure, traiter l’échantillon avec du formaldéhyde à 4% et du PBS comme solution de fixation à température ambiante pendant cinq minutes.
Ensuite, lavez la poussée de l’échantillon avec du PBS pendant cinq minutes chacune, suivie de l’ajout d’anticorps secondaire anti-humain de chèvre Alexa Fluor 488 à une dilution de un à 1000 pendant une heure à température ambiante. Ensuite, montez les bordereaux de couvercle contenant l’échantillon avec un support de montage liquide et aspirez tout liquide restant. Visualisez les neurones avec l’imagerie par fluorescence.
Pour l’imagerie du calcium, utiliser 14 à 18 jours in vitro des cellules qui ont été cultivées sur des lamelles de couverture. Avant l’imagerie, traiter les cellules avec le vecteur viral codant pour pAAV2 CAG GCaMP 5G à 2,5 fois 10 à la 10e copie du génome par millilitre pendant cinq à sept jours. Un jour avant l’imagerie, incuber les cellules avec l’échantillon du patient pendant 24 heures.
Le jour de l’imagerie, préparez l’installation et réglez la chambre de la cellule du microscope à 37 degrés Celsius. Remplissez la voie avec de l’eau distillée, infusez-la avec 5% de dioxyde de carbone pour maintenir les conditions physiologiques des cellules. Après avoir recouvert les cellules d’une solution physiologique extracellulaire, transférez-les dans la chambre cellulaire du microscope.
Ajoutez 10 micromolaires NBQX pour bloquer les récepteurs AMPA et KA et visualisez la réponse du récepteur NMDA. Acquérir le film de quatre minutes avec les images enregistrées toutes les 100 millisecondes. Peu de temps après le début de l’acquisition, ajoutez une solution de stimulation au plat.
Lors de la stimulation, extraire le signal fluorescent au fil du temps de la culture incubée avec le témoin et les échantillons de liquide céphalo-rachidien ou de LCR du patient à l’aide d’un logiciel de traitement tel que Image J.It a été observé que les cellules d’une journée in vitro étaient uniformément réparties et ont adhéré à la plaque avec une lamelle se développant autour du corps cellulaire et des neurites mineurs commençant à s’étendre. Après quelques jours en culture, les neurites se sont étendus sur une courte distance et les cellules ont montré une polarisation significative. Le réseau neuronal n’a cessé de croître et est devenu complexe.
À 18 jours, les neurones étaient matures, interconnectés et construisaient le réseau neuronal. Les images fluorescentes représentatives montrent des neurones matures à 18 jours en utilisant des marqueurs sélectifs. L’incubation des cultures avec les échantillons de patients a produit un signal de fluorescence intense car il contient les auto-anticorps qui ont reconnu le récepteur NMDA présent à la surface des neurones.
En revanche, les échantillons témoins n’ont produit aucun signal fluorescent lorsqu’ils ont été administrés aux cultures neuronales. L’application de NMDA a augmenté l’intensité de fluorescence comme indiqué par un changement dans la fluorescence verte intracellulaire. Lorsque le stimulateur a été appliqué, les neurones traités avec l’échantillon témoin de LCR ont montré une différence d’intensité de fluorescence plus élevée que les cellules traitées avec l’échantillon de LCR des patients.
L’identification des propriétés et la dissection de l’hippocampe déterminent la pureté des cultures. L’agrégation cellulaire est un facteur clé, en particulier lors de l’utilisation des cultures à des fins d’imagerie. De plus, les neurones de l’hippocampe en culture peuvent être utilisés pour identifier de nouveaux anticorps et leurs antigènes cibles lorsqu’ils sont combinés avec des techniques d’immunoprécipitation et de spectrométrie de masse.
Cette technique a permis la caractérisation d’une nouvelle catégorie de maladies médiées par les anticorps. Par conséquent, il est essentiel dans l’étude du nouveau domaine de la nano-immunologie.
