يوفر البروتوكول الموصوف هنا تعليمات مفصلة حول تحليل المناطق الجينومية ذات الأهمية لإمكانات ترميز البروتين باستخدام phyloCSF على متصفح الجينوم UCSC سهل الاستخدام. يمكن ل PhloCSF تحديد أطر القراءة المفتوحة القصيرة المحفوظة بشكل فعال مع إمكانات ترميز البروتين الجزئي في المناطق الجينومية التي يتم شرحها حاليا على أنها غير مشفرة. يمكن استخدام الأساليب الموصوفة هنا بسهولة ويمكن تنفيذها من قبل الباحثين من جميع الخلفيات دون تدريب مسبق أو خبرة في المعلوماتية الحيوية أو علم الجينوم المقارن.
للبدء ، افتح نافذة متصفح الإنترنت وانتقل إلى جامعة كاليفورنيا سانتا كروز أو متصفح الجينوم UCSC. ضمن عنوان أدواتنا، حدد خيار محاور المسار. في علامة التبويب المحاور العامة، اكتب phyloCSF في مربع مصطلحات البحث.
ثم انقر فوق الزر البحث في المحاور العامة. اتصل ب phyloCSF بالنقر فوق زر الاتصال لاسم المحور phyloCSF. بعد النقر فوق اتصال، انتظر لإعادة التوجيه إلى صفحة بوابة متصفح الجينوم UCSC.
للاستعلام عن نوع مختلف، حدد الأنواع ذات الأهمية تحت عنوان التصفح أو حدد الأنواع بالنقر فوق الرمز المناسب، أو اكتب الأنواع في مربع النص الذي يقول، أدخل الاسم الشائع للأنواع أو معرف التجميع.باستخدام القائمة المنسدلة اختر التجميع للبحث تحت عنوان الموضع المحدد ثم أدخل رمز جين الموضع أو مصطلحات البحث في مربع الموضع أو مصطلح البحث وانقر فوق انتقل للتنقل إلى جين ذي أهمية على متصفح الجينوم. إذا أسفر البحث عن تطابقات متعددة ، فانتظر حتى تتم إعادة توجيهها إلى صفحة تتطلب تحديد موضع اهتمام ، فانقر فوق الجين المناسب للاهتمام. بعد الانتقال إلى متصفح الجينوم UCSC ، حدد أداة المحاذاة الشبيهة بالانفجار أو blat تحت أدواتنا التي تهدف إلى الاستعلام عن تسلسل معين من الحمض النووي أو البروتين.
بدلا من ذلك ، مرر مؤشر الماوس فوق علامة التبويب الأدوات وحدد خيار blat أو اتبع الرابط المحدد. باستخدام القائمة المنسدلة ، حدد الأنواع والجينوم والتجميع محل الاهتمام. بعد ذلك ، حدد نوع الاستعلام ، الصق تسلسل الاهتمام في مربع نص جينوم البحث اللطيف وانقر فوق إرسال.
بعد ذلك ، انقر فوق رابط المتصفح أسفل عنوان الإجراءات للانتقال إلى المنطقة الجينومية ذات الاهتمام. مسح بصري للمنطقة الجينومية ذات الأهمية لتسجيل مناطق phyloCSF بشكل إيجابي. استخدم ميزة التكبير/التصغير لتكبير المناطق ذات الأهمية لفحص خصائص التسلسل والبحث عن كودونات البدء والتوقف.
للتكبير يدويا ، اضغط مع الاستمرار على مفتاح shift وانقر مع الاستمرار فوق زر الماوس أثناء السحب على طول المنطقة محل الاهتمام. بدلا من ذلك، استخدم زري التكبير والتصغير في أعلى الصفحة للتنقل. قم بالتكبير حتى يصبح تسلسل النيوكليوتيدات أو القاعدة مرئيا.
مسح بصري لتسلسل المد النووي بالقرب من بداية ونهاية مناطق phyloCSF ذات التسجيل الإيجابي لتحديد كودونات البدء والتوقف العقابية. مرر مؤشر الماوس فوق عنوان العرض في أعلى الصفحة وانقر على خيار تحويل الجينومات الأخرى، ثم حدد الجينوم محل الاهتمام باستخدام القائمة المنسدلة أسفل عنوان الجينوم الجديد. حدد التجمع الجينومي الذي يهم تحت عنوان التجميع الجديد وانقر فوق الزر إرسال.
بمجرد أن يقوم المستعرض بإرجاع قائمة بالمناطق في التجميع الجديد مع التشابه. انقر على رابط موضع الكروموسوم للانتقال إلى المنطقة المتماثلة ذات الاهتمام. اتبع استراتيجيات التنقل الموضحة سابقا لتحليل التسلسل.
للانتقال إلى صفحة وصف الجينات، انقر على الجين الذي يهم في مسار شفرة الجيل على متصفح الجينوم UCSC. ضمن عنوان التسلسل والروابط إلى الأدوات وقواعد البيانات ، انقر فوق الرابط الموجود في الجدول الذي يقرأ الأنواع الأخرى بشكل أسرع. انقر على المربعات المرتبطة بالأنواع ذات الأهمية لتحديدها.
ثم انقر فوق إرسال. انسخ التسلسلات التي تظهر في أسفل الصفحة والصقها بتنسيق أسرع في مستند معالجة النصوص. بعد ذلك ، افتح نافذة متصفح ثانية وانتقل إلى أداة محاذاة تسلسل أوميغا المتعدد على موقع المعهد الأوروبي للمعلوماتية الحيوية.
الصق ملفات التسلسل الموجودة على الحافظة في المربع في الخطوة الأولى التي تقرأ التسلسلات بأي تنسيق مدعوم. مرر إلى أسفل الصفحة وانقر على إرسال. لاحظ أدناه النتائج المحاذاة للرموز التي تشير إلى درجة حفظ كل حمض أميني.
لعرض خصائص الأحماض الأمينية واللون ، انقر فوق رابط إظهار الألوان مباشرة فوق التسلسلات لتلوين الأحماض الأمينية وفقا لخصائصها. ثم انسخ محاذاة التسلسل والصقها في برنامج معالجة النصوص أو عرض الشرائح لإنشاء ملف شكل أو رسم توضيحي. لعرض المخرجات الأخرى من صفحة نتائج أوميغا الكلوستال ، انقر فوق شجرة دليل علامات التبويب أو شجرة الفيلو الوراثية.
أخيرا ، انقر فوق علامة تبويب عارض النتائج للحصول على خيارات لعرض معلومات التسلسل باستخدام jalview أو للوصول إلى روابط مباشرة إلى mview وعلم الوراثة البسيط. يشير تحليل phyloCSF التمثيلي لجين الميتوريغولين إلى منطقة حفظ عالية التسلسل تتوافق مع بروتين دقيق تم التحقق منه. يتم تضمين تسلسل ترميز الميتوريغولين الكامل داخل exon one ويسجل درجات عالية جدا على phyloCSF ناقص مسار واحد.
يمكن ملاحظة كودون البدء المحفوظ في بداية منطقة التسجيل الإيجابية في phyloCSF ناقص مسار واحد. تبدأ منطقة التسجيل الإيجابية في أول إكسون من الميتوريغولين مباشرة فوق كودون البداية وتنتهي عند كودون التوقف. يتم عرض محاذاة التسلسل المتعدد للبروتين الدقيق ميتوريغولين لثمانية أنواع مختلفة هنا.
أظهر تحليل الهواء الساخن الطويل غير المشفر للحمض النووي الريبي درجة سلبية في جميع أنحاء الجين بأكمله عبر جميع المسارات الستة مما يشير إلى عدم الحفاظ على التسلسل ويدعم أن الهواء الساخن مشروح بشكل صحيح على أنه حمض نووي ريبي غير مشفر. أظهر تحليل PhyloCSF للفأر واحد ، ثمانية ، واحد ، صفر ، صفر ، خمسة ، ثمانية ، I 24 rike gene أن إطار القراءة المفتوح المحفوظ يمتد على ثلاثة إكسونات وأن درجة phyloCSF الإيجابية تقفز من المسار زائد اثنين في إكسون واحد إلى مسار زائد ثلاثة في إكسون اثنين ، ثم العودة إلى زائد اثنين المسار في إكسون ثلاثة. كما تم استخدام تحليل PhyloCSF لموضع جين واحد بشكل فعال لتحديد إطارات قراءة مفتوحة متعددة متميزة للترميز داخل جزيء RNA واحد.
من المهم ملاحظة أنه في حين أن درجة phyloCSF الإيجابية توحي بشدة بقدرة ترميز البروتين الجزئي ، فإن هذا الخط من الأدلة لا يمكن أن يقف بمفرده ويجب التحقق من صحته تجريبيا. بمجرد تحديد فترة من البروتين الدقيق ، يمكن تحليل تسلسل الأحماض الأمينية للمجالات المحفوظة أو خصائص التسلسل لتوفير نظرة ثاقبة لوظيفتها. تم استخدام PhyloCSF بشكل فعال لتحديد البروتينات الدقيقة الجديدة في المناطق الجينومية التي كان يعتقد سابقا أنها غير مشفرة وستظل أداة مفيدة في دراسات تحديد البروتين الجزئي المستقبلية.
