Burada açıklanan protokol, kullanıcı dostu UCSC genom tarayıcısında filoCSF kullanarak protein kodlama potansiyeli için ilgilenilen genomik bölgeleri analiz etme konusunda ayrıntılı talimatlar sağlar. PhloCSF, şu anda kodlama dışı olarak ek açıklama eklenmiş genomik bölgelerde mikro protein kodlama potansiyeline sahip korunmuş kısa açık okuma çerçevelerini etkili bir şekilde tanımlayabilir. Burada açıklanan yöntemler kolayca kullanılır ve biyoiformatik veya karşılaştırmalı genomik konusunda önceden eğitim veya uzmanlık olmadan tüm geçmişlerden araştırmacılar tarafından uygulanabilir.
Başlamak için bir internet tarayıcısı penceresi açın ve California Santa Cruz Üniversitesi veya UCSC genom tarayıcısına gidin. Araçlarımız başlığı altında, izleme hub'ları seçeneğini belirleyin. Genel hub'lar sekmesinde, arama terimleri kutusuna phyloCSF yazın.
Ardından, genel hub'ları ara düğmesine tıklayın. phyloCSF hub adı için bağlan düğmesine tıklayarak phyloCSF'ye bağlanın. Bağlan'a tıkladıktan sonra, UCSC genom tarayıcısı ağ geçidi sayfasına yönlendirmek için bekleyin.
Farklı bir türü sorgulamak için, uygun simgeye tıklayarak göz atma veya tür seçme başlığı altında ilgilenilen türü seçin veya türlerin ortak adını veya montaj kimliğini girin yazan metin kutusuna türleri yazın.Açılır menüyü kullanarak tanımlı konum başlığı altında aranacak montajı seçin, ardından konum veya arama terimi kutusuna konum gen sembolünü veya arama terimlerini girin ve gezinmek için git'e tıklayın genom tarayıcısında ilgilenilen bir gene. Arama, birden fazla eşleşmenin ilgilenilen bir konumun seçilmesini gerektiren bir sayfaya yönlendirilmeyi beklemesiyle sonuçlandıysa, ilgili uygun geni tıklayın. UCSC genom tarayıcısına gittikten sonra, belirli bir DNA veya protein dizisini sorgulamak için araçlarımız başlığı altında patlama benzeri hizalama aracını veya gafı seçin.
Alternatif olarak, imleci araçlar sekmesinin üzerine getirin ve blat seçeneğini belirleyin veya verilen bağlantıyı izleyin. Açılır menüyü kullanarak ilgilenilen türü, genomu ve derlemeyi seçin. Ardından, sorgu türünü tanımlayın, ilgilendiğiniz sırayı blat arama genomu metin kutusuna yapıştırın ve gönder'i tıklayın.
Ardından, ilgilenilen genomik bölgeye gitmek için eylemler başlığının altındaki tarayıcı bağlantısına tıklayın. FiloCSF bölgelerinin pozitif skorlanması için genomik ilgi alanını görsel olarak tarayın. Dizi özelliklerini incelemek ve başlangıç ve bitiş kodonlarını aramak üzere ilgilenilen bölgeleri büyütmek için yakınlaştırma özelliğini kullanın.
Yakınlaştırmak için manuel olarak shift tuşunu basılı tutun ve ilgilenilen bölge boyunca sürüklerken fare düğmesini tıklatıp basılı tutun. Alternatif olarak, gezinmek için sayfanın üst kısmındaki yakınlaştırma ve uzaklaştırma düğmelerini kullanın. Nükleotid veya baz dizisi görünene kadar yakınlaştırın.
Cezalandırıcı başlangıç ve durdurma kodonlarını tanımlamak için pozitif skorlama filoCSF bölgelerinin başlangıcına ve sonuna yakın nükleer gelgit dizisini görsel olarak tarayın. Fare imlecini sayfanın üst kısmındaki görünüm başlığının üzerine getirin ve Diğer genomları dönüştür seçeneğini tıklayın, ardından yeni genom başlığının altındaki açılır menüyü kullanarak ilgilendiğiniz genomu tanımlayın. Yeni derleme başlığı altında ilgilendiğiniz genomik derlemeyi seçin ve gönder düğmesine tıklayın.
Tarayıcı, yeni derlemedeki benzer bölgelerin bir listesini döndürdüğünde. İlgilenilen homolog bölgeye gitmek için kromozom konumu bağlantısına tıklayın. Diziyi analiz etmek için daha önce açıklanan gezinme stratejilerini izleyin.
Gen açıklama sayfasına gitmek için, UCSC genom tarayıcısındaki gen kodu parçasında ilgilenilen gene tıklayın. Sıralama ve araçlar ve veritabanlarına bağlantılar başlığı altında, tablodaki diğer türleri daha hızlı okuyan bağlantıya tıklayın. Seçmek için ilgilenilen türlerle ilişkili kutulara tıklayın.
Ardından, gönder'e tıklayın. Sayfanın altında görünen dizileri kopyalayıp daha hızlı biçimde bir sözcük işlem belgesine yapıştırın. Ardından, ikinci bir tarayıcı penceresi açın ve Avrupa Biyoinformatik Enstitüsü web sitesindeki clustal omega çoklu dizi hizalama aracına gidin.
Panodaki dizi dosyalarını, desteklenen herhangi bir formattaki dizileri okuyan birinci adımdaki kutuya yapıştırın. Sayfanın en altına gidin ve gönder'i tıklayın. Her amino asidin korunum derecesini gösteren semboller için hizalanmış sonuçların altına dikkat edin.
Amino asit özelliklerini ve rengini görüntülemek için, amino asitleri özelliklerine göre renklendirmek için dizilerin hemen üstündeki renkleri göster bağlantısına tıklayın. Ardından, bir şekil veya illüstrasyon dosyası oluşturmak için sıra hizalamasını kopyalayıp bir sözcük işlem veya slayt gösterisi programına yapıştırın. Klüstal omega sonuçları sayfasından diğer çıktıları görüntülemek için, sekmeler kılavuz ağacına veya filo genetik ağacına tıklayın.
Son olarak, jalview kullanarak dizi bilgilerini görüntüleme veya mview ve basit filogeniye doğrudan bağlantılara erişme seçenekleri için sonuç görüntüleyicinin sekmesine tıklayın. Mitoregülin geninin temsili bir filoCSF analizi, doğrulanmış bir mikro proteine karşılık gelen yüksek sekanslı bir korunum bölgesini gösterir. Tam mitoregulin kodlama dizisi ekzon bir içinde bulunur ve filoCSF eksi bir parça üzerinde çok yüksek puan alır.
Korunmuş bir başlangıç kodonu filoCSF eksi bir parçadaki pozitif puanlama bölgesinin başlangıcında gözlemlenebilir. Mitoregülünin ilk ekzonundaki pozitif skorlama bölgesi doğrudan bir başlangıç kodonu üzerinden başlar ve durdurma kodonunda sona erer. Sekiz farklı tür için mikro protein mitoregulinin çoklu sekans hizalaması burada gösterilmiştir.
Uzun kodlamayan RNA sıcak havasının analizi, altı parçanın tamamında tüm gen boyunca negatif bir skor gösterdi ve dizi korunumu eksikliğini gösterdi ve sıcak havanın kodlamayan bir RNA olarak doğru bir şekilde açıklandığını destekledi. Fare bir, sekiz, bir, sıfır, sıfır, beş, sekiz, I 24 rike geninin filoCSF analizi, korunmuş bir açık okuma çerçevesinin üç ekzonu kapsadığını ve pozitif filoCSF skorunun ekzon birdeki artı iki parçadan ekzon ikideki artı üç parçaya ve daha sonra ekzon üçteki artı iki parçaya geri döndüğünü göstermiştir. Bir gen lokusunun filoCSF analizi, tek bir RNA molekülü içindeki çoklu farklı kodlama açık okuma çerçevelerini tanımlamak için de etkili bir şekilde kullanılmıştır.
Pozitif bir filoCSF skorunun mikro protein kodlama kapasitesini oldukça düşündürücü olmasına rağmen, bu kanıt çizgisinin tek başına duramayacağını ve deneysel olarak doğrulanması gerektiğini belirtmek önemlidir. Bir mikro protein periyodu tanımlandıktan sonra, amino asit dizisi, işlevi hakkında fikir vermek için korunmuş alanlar veya dizi özellikleri için analiz edilebilir. PhyloCSF, daha önce kodlamadığı düşünülen genomik bölgelerdeki yeni mikro proteinleri tanımlamak için etkili bir şekilde kullanılmıştır ve gelecekteki mikro protein tanımlama çalışmalarında yararlı bir araç olmaya devam edecektir.
