نشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث (NSERC) وجمعية السرطان الكندية للحصول على الدعم المالي. وبفضل SCCS NSERC VNL يشكر أونتاريو العليا للمنح الدراسية (معرض النفط والغاز) برنامج المنح الدراسية للدراسات العليا. ARW بفضل اتفاقية حقوق الطفل لكرسي أبحاث كندا.

الجزء 1 : تصنيع الأجهزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ركائز الزجاج النظيفة في حل سمكة البيرانا (3:1 اضرب حامض الكبريتيك : 30 ٪ بيروكسيد الهيدروجين). مغادرة ركائز في حل سمكة البيرانا لمدة 10 دقيقة مع التحريض المتكرر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد شطف في الماء (DI) منزوع الأيونات وتجفيف الغاز مع ركائز 2 N ، وضع ركائز داخل غرفة شعاع الالكترون لترسيب الكروم (سمك من 250 نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليذوى الركيزة الكروم المغلفة ، وشطف في الأيزوبروبانول ثم يخبز على طبق ساخن لمدة 5 دقائق في 115 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف ورئيس ركائز مع hexamethyldisilazane (HMDS) بواسطة طلاء الجانبية (30 ق ، 3000 دورة في الدقيقة). تدور معطف مرة أخرى (باستخدام معلمات متطابقة) مع مقاومة للضوء S1811 شيبلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل خبز الركيزة على طبق ساخن (100 درجة مئوية ، 2 دقيقة) ، ثم نمط مقاومة للضوء عن طريق التعرض لأشعة (UV) فوق البنفسجية لمدة 5 ليالي من خلال الضوئية الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير ركائز للأشعة فوق البنفسجية التي تتعرض لها من المطور شيبلي MF 321 لمدة 3 دقائق وتغسل في مياه DI. بعد الخبز على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر الكروم كشفها بواسطة تخبط في ضوئي لمدة 30 ثانية. الكروم شطف المياه في دي ، ثم تزج في متجرد AZ300T لمدة 10 دقيقة لإزالة مقاوم الضوء المتبقية. شطف في الماء والجافة DI بالغاز 2 N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ودائع 2-5 ميكرومتر Parylene - C (وهو بوليمر عازل) بواسطة ترسب الأبخرة الكيميائية تؤثر على نمط الركيزة الكروم. إيداع 50 نانومتر من تفلون - AF (لجعل سطح مسعور) التي تدور حل طلاء (1 ٪ بالوزن / بالوزن في Fluorinert FC - 40) في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية. بعد الخبز على طبق ساخن (160 درجة مئوية و 10 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشكيل الصفيحة العلوية ، ومعطف ملف. الامم المتحدة منقوشة الإنديوم أكسيد القصدير (ITO) والزجاج ركائز 50 نانومتر تفلون ، بالعربية ، على النحو الوارد أعلاه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خبز كل من ركائز على طبق ساخن (160 درجة مئوية و 10 دقيقة). </li></ol> الجزء 2 : تعيين جهاز المتابعة والتنفيذ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أجهزة ميكروفلويديك الرقمية تعمل في تكوين &quot;اثنين من لوحة&quot; ، يتم وضع قطرات بين 1 ركيزة القاع (مع أقطاب منقوشة) والركيزة الأولى (مع واحدة القطب ، متجاورة شفافة ، وشكلت عادة من ITO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضبط الجهاز حتى إزالة الطلاء البوليمر من منصات الاتصال ركيزة أسفل عن طريق كشط لطيف مع مشرط. يتعرض الزوجان لمنصات الركيزة القاع برصيد 40 دبوس الموصلات (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السلطة على كمبيوتر يشغل LABVIEW (الصكوك الوطنية ، أوستن ، تكساس) ، منزل بنيت مربع عنصر التحكم (يضم مجموعة من عالية الجهد التبديلات التي يتم التحكم فيها بواسطة إشارات من DaqPad الصكوك الوطنية) ، ومولد وظيفة ، ومكبر للصوت . مربع الكمبيوتر / السيطرة يسهل على المستخدم التحكم تطبيق RMS V 100 / 18 كيلو هرتز إشارات إلى الجهاز عن طريق وصلات من 40 دبوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الجهاز عن طريق وضع قطعتين من الشريط على الوجهين (140 ميكرون سمك الكل) على حواف الركيزة القاع وكاملة مع الشرائح ITO unpatterned (الصفيحة العلوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتهيئة نظام التحكم ، تشغيل برنامج المعايرة LABVIEW (مكتوبة في المنزل) لمعايرة تحكم التغذية المرتدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينة والكواشف في الخزانات المناسب (انظر القسم 3 أدناه) ، وأرفق بها في إطار الركيزة الأولى (تفلون المغلفة الجانب لأسفل). إرفاق موصل الأرض إلى أعلى الركيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل رمز يشتغل في LABVIEW (مكتوبة في المنزل) وتنفيذ برنامج لبدء يشتغل الحبرية. </li></ol> الجزء 3 : نموذج تحضير والكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة العمل (البنك الدولي) : 100 مم TrisHCl (الرقم الهيدروجيني 7.8) وPluronic 0.08 ٪ F127 ث / ضد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل البروتين (ق) التي يتم تحليلها في الضفة الغربية وماصة العينة إلى خزان 1 (R - 1) على الجهاز ، كما هو مبين في الشكل 1B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مرسب ، حمض حمض التريكلوروسيتيك 20 ٪ (TCA) في مياه DI ، وماصة إلى R - 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد غسل العازلة ، والكلوروفورم 70/30 / أسيتونتريل (ACN) ، وماصة إلى R - 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد resolubilizing العازلة ، 100 ملي بيكربونات الأمونيوم (8.0 درجة الحموضة) و 0.08 ٪ Pluronic F127 ث / ت ، وماصة إلى R - 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل اختزال ، تريس (2 - carboxyethyl) الفوسفين (TCEP) ، في 10 مليمتر في الضفة الغربية وماصة في R - 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل وكيل مؤلكل ، iodoacetamide (IAM) ، في 12 مم في الضفة الغربية وماصة في R - 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل التريبسين في البنك الدولي على التركيز على قدم المساواة to1 / 5 من تركيز العينة البروتين الكلي (انظر 3.1 أعلاه) وماصة في R - 8. </li></ol> الجزء 4 : المعالجة الرقمية للنموذج ميكروفلويديك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تنفيذ الإجراء التالي تلقائيا عن طريق كتابة رمز LABVIEW في المنزل. ويعرف حجم قطرات الاستغناء عن الخزانات من أبعاد الأقطاب (في هذه الحالة ، يتم الاستغناء قطرات ~ 600nL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن قطرة من العينة التي تحتوي على البروتين من R - 1 ، وقطرة من مرسب من R - 2 (الشكل 2 ، الإطار 1). قطرات دمج اثنين والسماح للقطيرة مجتمعة لاحتضان لمدة 5 دقائق ، مما أدى إلى ترسب الأسبوعيةoteins على السطح (الشكل 2 ، اطارات 2-3). تحفيز وطاف بعيدا عن البروتين عجل إلى خزان النفايات ، R - 3 (الشكل 2 ، الإطار 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء three قطرات من غسل العازلة R - 4 وطردهم عبر البروتين عجل إلى خزان النفايات ، R - 3 (الشكل 2 ، الإطار 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتعجل لتجف ، والاستغناء بقطرة من resolubilizing العازلة من R - 5 للبروتين. تسمح المخزن المؤقت لاحتضان لمدة 20 دقيقة حتى يعجل قد حلت (الشكل 2 ، الإطار 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء بقطرة من مختزل من R - 6 ودمجه مع قطرات العينة. مزيج قطرة يجمعهما التي تحرك ذلك عبر 6 أقطاب في نمط دائري. يسمح الحبرية لاحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب (الشكل 3 ، اطارات 1-2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء بقطرة من عامل مؤلكل من R - 7 ودمجها مع قطرات العينة ، تليها خلط (كما في 4.5). يسمح الحبرية لاحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب ، محمية من الضوء (الشكل 3 ، اطارات 2-3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء بقطرة من التربسين من R - 8 ، ودمج ذلك مع قطرات العينة ، تليها خلط (كما في 4.5). يسمح الحبرية لاحتضان لمدة 3 ساعات في غرفة 37 في ترطيب على طبق ساخن (الشكل 3 ، اطارات 3-4) درجة مئوية. </li></ol> الجزء 5 : بعد تجهيز وإعداد العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الركيزة أعلى وإخماد ردة فعل الهضم عن طريق إضافة 0.6 مل من حمض trifluoroacetic 2.5 ٪ في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية تطفئ ناتج التفاعل باستخدام ZipTips C18 (ميليبور ، فالجهاز يبث اشعة تماثل ، MA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تنقية العينة في الماء DI إلى الحجم النهائي 100 مل. </li></ol> الجزء 6 : قداس الطيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم العينة المجهزة على نانو HPLC تزاوج مطياف الكتلة جنبا إلى جنب. استخدام نظام HPLC هنا هو من تقنيات Eksigent ومجهز مع عمود فخ (3 مم. الخرز C18 ، 150 × 2.5 ميكرومتر معرف سم) وعمود فصل عكس المرحلة (3 ديا ميكرون. الخرز C18 ، 75 ميكرومتر معرف س 15 سم). مطياف الكتلة المستخدمة هنا هي من LTQ الحرارية فيشر العلمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينة 2 ميكرولتر على العمود في فخ 5μL/min في مرحلة النقالة تضم أسيتونتريل 5 ٪ في الماء. فصل العينة على عكس المرحلة العمود في 0.5μL/min باستخدام الانحدار الخطي أسيتونتريل من 20 ٪ إلى 80 ٪ خلال أسيتونتريل 25 دقيقة. متابعة تشغيل في أسيتونتريل 80 ٪ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل نطاقات يبلغ حجمه قبالة العمود بواسطة مطياف الكتلة جنبا إلى جنب. وذكرت في عمل هنا ، هو عينات شاطف في مطياف الكتلة عبر باعث nanoelectrospray (20 ميكرومتر مدبب معرف إلى معرف ميكرومتر 10) من NewObjective. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على البروتينات في عينة البحث باستخدام برنامج قاعدة بيانات مثل SEQUEST. في هذا العمل ، كنا إصدار SEQUEST تأسست في Bioworks v3.01 (الحرارية فيشر العلمية) ، والبروتينات التي تم تحديدها كان عشرات من احتمال أقل من 03 - 1.0E (أي ما يعادل 99.9 ٪ فاصل الثقة) ، وتسلسل في التغطيات لا يقل عن 30 ٪ (الشكل 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> الشكل 1 (أ) صورة جهاز DMF تزاوج إلى 40 دبوس وصلات ليشتغل الحبرية الآلي. (ب) التخطيطي لجهاز تحديد المواقع المسيئة للعينة والكواشف اللازمة لworkup البروتين. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> الشكل 2. إطارات من فيلم يصور الاستخراج الآلي وتنقية جيش صرب البوسنة في TCA 20 ٪ (مرسب) و 70/30 أسيتونتريل ٪ كلوروفورم / (شطف الحل). في الإطار 6 ، redissolved البروتين عجلت في قطيرة من 100 ملي بيكربونات الأمونيوم. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> الشكل 3. الإطارات من الفيلم توضح الحد متسلسلة ، الألكلة ، وهضم قطرات من البروتين resolubilized. في هذا الشكل ، ولون الكواشف مع الأصباغ وضوح ، في الممارسة ، والكواشف ليست ملونة. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> chromatogram MS الرقم 4. عينة من زلال مصل بقري معالجتها من قبل على microfluidics الرقمية. وقد تم تحديد 25 الببتيدات متميزة (99.9 ٪ فاصل الثقة) المقابلة تغطية سلسلة من 44 ٪.

<ol>
	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

عدم وجود نموذج موحد المناولة والتجهيز في وجود قيود البروتيوميات الرئيسية للحقل. بالإضافة إلى ذلك ، التقليدية مناولة الحاويات يشمل عينة macroscale متعددة ونقل الحل الذي يمكن أن يؤدي إلى فقدان العينة والتلوث. وهناك حل محتمل لهذه المشاكل هو تشكيل نظم متكاملة لمعالجة الاعتم...

digital microfluidics for automated proteomic processing

وقد برزت البروتيوميات السريرية والانضباط جديد مهم ، واعدا لاكتشاف المؤشرات الحيوية التي من شأنها أن تكون مفيدة للتشخيص المبكر والتشخيص للمرض. في حين أن الأساليب تختلف البروتين سريرية على نطاق واسع ، وهي سمة مشتركة هي الحاجة إلى (ط) استخراج البروتينات من السوائل غير متجانسة للغاية (أي مصل الدم كله ، الخ) و (ب) تجهيز البيوكيميائية واسعة النطاق قبل التحليل. هنا ، نحن تقرير رقمية جديدة على microfluidics (DMF) الأسلوب يستند دمج عدة خطوات المعالجة المستخدمة في البروتيوميات السريرية. وهذا يشمل استخراج البروتين ، resolubilization ، والحد ، والهضم ألكلة الأنزيمية. الرقمية على microfluidics هو الميكروسكيل معالجة السوائل التقنية التي يتم التلاعب قطرات نانولتر - ميكروليتر الحجم على سطح مفتوح. يتم وضع قطرات على رأس مجموعة من الأقطاب الكهربائية التي تكون مغلفة بطبقة عازلة -- عندما يتم تطبيق الجهد الكهربائي على الحبرية ، والرسوم تتراكم على جانبي عازلة. هذه الاتهامات بمثابة مقابض الكهروستاتيكية التي يمكن استخدامها للسيطرة على الموقف الحبرية ، ويتحامل سلسلة من الأقطاب الكهربائية في سلسلة ، ويمكن إجراء قطرات على الاستغناء ، ونقل ، دمج ، مزيج ، والانقسام على السطح. لذلك ، DMF مادة طبيعية ملائمة لنقل ، متسلسلة السريع ، ومتعددة الخطوات ، المنمنمة فحوصات البيوكيميائية الآلي. هذا يمثل تقدما كبيرا على الأساليب التقليدية (التي تعتمد على pipetting اليدوي أو الروبوتات) ، ولديه القدرة على أن تكون أداة مفيدة جديدة في البروتيوميات السريرية. ساهم ميس J. جبرايل ، فيفيان N. وقا ، وستيف شيه CC بالتساوي على هذا العمل. عنوان سيرجيو LS فريري الحالي هو في جامعة العلوم في فيلادلفيا يقع في 600 شارع 43 جنوب ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا 19104.

Watch this Scientific Journal Video about Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing at JoVE.com

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

على microfluidics الرقمية هي تقنية تتميز التلاعب قطرات منفصلة (~ NL -- مل) على مجموعة من الأقطاب الكهربائية من تطبيق الحقول الكهربائية. انها مناسبة تماما للاضطلاع ، المتسلسل السريع ، المنمنمة الآلي فحوصات البيوكيميائية. هنا ، نحن تقرير منصة قادرة على أتمتة العديد من خطوات التجهيز البروتين.

الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Views.  University of Toronto. على microfluidics الرقمية هي تقنية تتميز التلاعب قطرات منفصلة (~ NL -- مل) على مجموعة من الأقطاب الكهربائية من تطبيق الحقول الكهربائية. انها مناسبة تماما للاضطلاع ، المتسلسل السريع ، المنمنمة الآلي فحوصات البيوكيميائية. هنا ، نحن تقرير منصة قادرة على أتمتة العديد من خطوا...

Video: Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

الكيميائي استجابة الكائنات المجهرية البحرية الصغيرة الحجم لطبقات غذائية

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

دراسات لاستخدام الانجذاب الكيميائي الجرثومي على microfluidics -- مقابلة

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

تطبيق على microfluidics لالكهربية

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

تطوير تطبيقات علاجية جديدة باستخدام على microfluidics

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

الكهربي فصل البروتينات

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

تحليل طخة مناعية

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

تلطيخ البروتينات في الهلام

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

التعريفي واستخراج السم من البروتين فيوزاريوم النيابة. الثقافات للدراسات البروتين

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

نزع الأحشاء من الشبكية والسائل الزجاجي ماوس للتحليلات البروتين

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...