يمكن لبروتوكولنا تحديد الديناميكيات في العديد من الأنظمة باستخدام مجموعة من تقنيات الفحص المجهري الضوئي. نسلط الضوء على كيف يمكن لهذه الطريقة ، على وجه الخصوص ، أن تساعد في توصيف ديناميكيات شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها. الميزة الرئيسية لاستخدام حزمة برامج المجهر الديناميكي التفاضلي لدينا هي أنها موثقة جيدا ، وتحتوي على ملفات تحليل أمثلة متعددة ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة أنواع مختلفة من الديناميكيات.
يمكن استخدام حزمة برامجنا لتحديد الديناميكيات ليس فقط في شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها ، ولكن أيضا في المواد الأخرى الناعمة وذات الصلة بيولوجيا. استنادا إلى مقاييس الوقت والطول للتحقيق ، يمكنك الحصول على تسلسلات صور تزيد عن 1000 إطار باستخدام برنامج التحكم في المجهر ، مثل Micro-Manager. ضمن مجلد الأمثلة المتوفر في مستودع التعليمات البرمجية PyDDM، قم بعمل نسخة من ملف المعلمة المسمى example_parameter_file.yml.
افتح ملف EML هذا باستخدام محرر نصوص مثل Notepad + أو محرر النصوص في JupyterLab. في ملف EML المنسوخ ، قم بتوفير دليل البيانات واسم الملف المقابل لتسلسل الصورة المراد تحليله. ضمن قسم البيانات الأولية، قم بتوفير حجم البكسل ومعدل الإطارات.
ضمن قسم معلمة التحليل، حدد المعلمات لحساب مصفوفة DDM، مثل عدد أوقات التأخير المختلفة وأطول وقت تأخير. قدم تفاصيل حول تركيب مصفوفة DDM أو دالة التشتت الوسيطة في قسم معلمة التركيب، مثل اسم النموذج ومعلمة النموذج، والتخمين الأولي، والحد الأدنى والحد الأعلى. تهيئة مثيل من فئة تحليل DDM عن طريق توفير بيانات التعريف في معلمات التحليل عن طريق تمرير اسم ملف ملف EML مع مسار الملف الكامل إلى تحليل DDM.
بدلا من ذلك ، قم بتمرير البيانات الوصفية والمعلمات كبنية بيانات قاموس بايثون. قم بتشغيل الدالة لحساب مصفوفة DDM. افحص البيانات التي تم إرجاعها باستخدام المتغيرات وبيانات التعريف المقترنة، والتي يتم تخزينها كمجموعة بيانات في حزمة Xarray .
ثم افحص المؤامرات والأشكال ، والتي يتم حفظها كملف PDF ودليل البيانات. تعرض إحدى هذه المؤامرات الطريقة الافتراضية لكيفية تقدير الخلفية. إذا لزم الأمر، قم بتغيير الطريقة التي يتم بها تقدير الخلفية باستخدام طريقة خلفية المعلمة في ملف EML أو كوسيطة كلمة رئيسية اختيارية لدالة حساب مصفوفة DDM.
قم بتهيئة مثيل من فئة ملاءمة DDM عن طريق تمرير اسم ملف ملف EML الذي يحتوي على بيانات تعريف الصورة ومعلمات الملائمة. قم بإدراج النماذج المتوفرة عن طريق تنفيذ نماذج تركيب الطباعة الوظيفية. حدد النموذج المراد استخدامه في ملف معلمة EML أو باستخدام نموذج ملاءمة إعادة تحميل الدالة حسب الاسم.
لكل معلمة في النموذج المختار، قم بتعيين التخمينات والحدود الأولية إذا كانت مختلفة عن القيم المحددة في ملف EML باستخدام الدالات تعيين المعلمة التخمين الأولي وتعيين حدود المعلمة. تنفيذ الملاءمة مع ملاءمة الوظيفة. قم بإنشاء مخططات لفحص الملاءمة في اعتماد q لمعلمات الملاءمة مع تقرير ملاءمة الوظيفة.
تحقق من الإخراج بما في ذلك الشكل مع اثنين في اثنين من المخططات الفرعية التي تظهر مصفوفة DDM أو ISF عند أربع قيم q جنبا إلى جنب مع الملاءمة. استخدم الفئة استعراض DDM يناسب بيئة Jupyter Notebook لرسم مصفوفة DDM أو ISF جنبا إلى جنب مع أفضل ملاءمة بطريقة تفاعلية. سيؤدي النقر فوق نقطة في مخطط وقت الاضمحلال مقابل الرقم الموجي إلى إظهار البيانات والملاءمة.
تحقق من نتائج الملاءمة المحفوظة في مجموعة بيانات Xarray واستخدم الوظيفة اثنين من netCDF أو وحدة المخلل المدمجة في Python لحفظ بنية البيانات هذه على القرص. تم إجراء تحليل DDM على سلسلة صور برايتفيلد المكونة من خرز 0.6 ميكرون في شبكة vimentin وصور مجهرية متحدة البؤرة من شبكة مركبة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة مع ملصقات فلورسنت متميزة الطيفيا. تم رسم دوال التشتت الوسيطة كدالة لوقت التأخر عند أعداد موجية مختلفة وشبكة بتركيز فيمنتين يبلغ 19 ميكرومولار و 34 ميكرومولار.
تشير الهضبة الزمنية الطويلة للدالة عند قيمة أعلى بكثير من الصفر إلى عدم الارتجالية. يظهر وقت الاضمحلال الذي رسمه تاو كدالة q لشبكتين بتركيزات فيمنتين مختلفة للحركة شبه المنتشرة أو المحصورة. أظهرت معلمات عدم الإرغودية c المرسومة كدالة q تربيعت للشبكة مع 34 و 49 micromolar vimentin أن سجل c كان متناسبا مع q تربيعا كما هو متوقع للحركة المحصورة.
أظهر متوسط الإزاحة المربعة مقابل مخططات وقت التأخر أن القيم المحددة من DDM تتفق بشكل جيد مع تلك الموجودة من خلال تتبع الجسيمات المفردة. بالنسبة للشبكة الأكثر تركيزا ، فإن هضاب القيمة في أوقات تأخير أطول. أظهرت مصفوفة DDM مقابل وقت التأخر لشبكة مركبة نشطة من الأكتين والأنابيب الدقيقة أن مصفوفة DDM لقيمة q معينة لها هضبة في أوقات تأخير منخفضة ، ثم زادت في مزيد من الاستقرار في أوقات التأخر الكبيرة.
تظهر أوقات الاضمحلال المميزة تاو من الملاءمة إلى مصفوفة DDM أن العلاقة بين تاو و q تشير إلى الحركة الباليستية. بعد تطوير حزمة برامج PyDDM هذه ، استخدمناها للتحقيق في الديناميكيات المتباينة والمتغيرة زمنيا لشبكات الهيكل الخلوي النشطة والأنظمة الأخرى.
