우리의 프로토콜은 다양한 광학 현미경 기술을 사용하여 많은 시스템에서 역학을 정량화 할 수 있습니다. 우리는이 방법이 특히 재구성 된 세포 골격 네트워크의 역학을 특성화하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 강조합니다. 우리의 차동 동적 현미경 소프트웨어 패키지를 사용하는 주요 장점은 잘 문서화되어 있고, 여러 예제 분석 파일을 가지고 있으며, 다양한 유형의 역학을 연구하기 위해 쉽게 적응할 수 있다는 것입니다.
우리의 소프트웨어 패키지는 재구성 된 세포 골격 네트워크뿐만 아니라 다른 부드럽고 생물학적으로 관련된 물질에서도 역학을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 프로브가 Micro-Manager와 같은 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 1, 000 프레임 이상의 이미지 시퀀스를 획득하는 시간 및 길이 스케일에 기초합니다. PyDDM 코드 리포지토리에 제공된 예제 폴더 아래에서 example_parameter_file.yml이라는 매개 변수 파일의 복사본을 만듭니다.
메모장 + 또는 JupyterLab의 텍스트 편집기와 같은 텍스트 편집기로이 EML 파일을 엽니 다. 복사된 EML 파일에서 분석할 이미지 시퀀스에 해당하는 데이터 디렉토리와 파일 이름을 제공합니다. 메타데이터 섹션 아래에서 픽셀 크기와 프레임 속도를 제공합니다.
분석 매개변수 섹션에서 DDM 행렬의 계산을 위한 매개변수(예: 다른 지연 시간 수 및 가장 긴 지연 시간)를 선택합니다. 피팅 매개변수 섹션의 DDM 행렬 또는 중간 산란 함수의 피팅에 대한 세부 정보(예: 모델 및 모델 매개변수의 이름, 초기 추측, 하한 및 상한)를 제공합니다. EML 파일의 파일 이름에 DDM 분석에 대한 전체 파일 경로를 전달하여 분석 매개변수에 메타데이터를 제공하여 DDM 분석 클래스의 인스턴스를 초기화합니다.
또는 메타데이터와 매개 변수를 Python 사전 데이터 구조로 전달합니다. 함수를 실행하여 DDM 행렬을 계산합니다. Xarray 패키지에 데이터 세트로 저장되는 관련 변수 및 메타데이터로 반환된 데이터를 검사합니다.
그런 다음 PDF 파일 및 데이터 디렉토리로 저장된 플롯과 그림을 검사하십시오. 이러한 플롯 중 하나는 배경을 추정하는 방법에 대한 기본 방법을 보여줍니다. 필요한 경우 EML 파일의 매개변수 배경 메소드를 사용하거나 함수 계산 DDM 행렬에 대한 선택적 키워드 인수로 배경을 추정하는 방법을 변경하십시오.
이미지 메타데이터 및 피팅 매개변수가 포함된 EML 파일의 파일 이름을 전달하여 DDM fit 클래스의 인스턴스를 초기화합니다. 기능 인쇄 피팅 모델을 실행하여 사용 가능한 모델을 나열합니다. EML 매개변수 파일에 사용할 모델을 지정하거나 이름별로 적합 모델 다시 로드 함수를 사용하여 지정합니다.
선택한 모델의 각 매개변수에 대해 함수 세트 매개변수 초기 추측 및 매개변수 경계를 설정하여 EML 파일에 지정된 값과 다른 경우 초기 추측 및 경계를 설정합니다. 함수 핏으로 핏을 실행합니다. 함수 적합도 보고서를 사용하여 적합 매개변수의 q 종속성에서 적합치를 검사하기 위한 플롯을 생성합니다.
적합도와 함께 네 개의 q 값에서 DDM 행렬 또는 ISF를 보여주는 두 개의 서브플롯이 있는 그림을 포함한 출력을 확인합니다. Jupyter 노트북 환경에 맞는 DDM 클래스 찾아보기를 사용하여 대화형 방식으로 가장 적합한 DDM 행렬 또는 ISF를 플로팅합니다. 감쇠 시간 대 파형 플롯의 점을 클릭하면 데이터와 적합도가 표시됩니다.
Xarray 데이터 세트에 저장된 적합의 결과를 확인하고 두 개의 netCDF 또는 Python의 내장 피클 모듈 함수를 사용하여이 데이터 구조를 디스크에 저장하십시오. DDM 분석은 vimentin 네트워크에서 0.6 미크론 비드의 브라이트필드 이미지 시리즈와 스펙트럼적으로 구별되는 형광 라벨을 갖는 활성 액틴-미세소관 복합체 네트워크로부터의 공초점 현미경 이미지에서 수행되었다. 중간 산란 함수는 상이한 파수 및 19 마이크로몰 및 34 마이크로몰의 비멘틴 농도를 갖는 네트워크에서의 지연 시간의 함수로서 플롯팅되었다.
0보다 훨씬 높은 값에서 함수의 긴 지연 시간 고원은 비인체성을 나타냅니다. 서로 다른 비멘틴 농도를 갖는 두 네트워크에 대해 q의 함수로 플롯된 붕괴 시간 타우는 서브-확산 또는 제한된 움직임을 보여준다. 34 및 49 마이크로몰 비멘틴을 갖는 네트워크에 대해 q제곱된 q의 함수로서 플롯된 비인체성 파라미터 c는 c의 로그가 제한된 운동에 대해 예상대로 q제곱에 비례한다는 것을 보여주었다.
평균 제곱 변위 대 지연 시간 플롯은 DDM에서 결정된 값이 단일 입자 추적을 통해 발견된 값과 잘 일치한다는 것을 보여주었습니다. 더 집중된 네트워크의 경우, 더 긴 지연 시간에서 값이 고원화됩니다. 활성 액틴-미세소관 복합체 네트워크에 대한 DDM 매트릭스 대 지연 시간은 특정 q 값에 대한 DDM 매트릭스가 낮은 지연 시간에서 고원을 가졌고, 그 후 큰 지연 시간에서 더 고원화되어 증가한다는 것을 보여주었다.
적합치에서 DDM 매트릭스까지의 특징적인 감쇠 시간 타우는 타우와 q 사이의 관계가 탄도 운동을 나타낸다는 것을 보여준다. 이 PyDDM 소프트웨어 패키지를 개발한 후, 우리는 활성 세포골격 네트워크 및 기타 시스템의 이방성 및 시간 변동 역학을 조사하는 데 이 패키지를 사용했습니다.
