تحتوي صفائف الأنابيب الدقيقة الخلوية على مجموعات فرعية من الأنابيب الدقيقة ذات الخصائص الديناميكية المميزة كما هو مطلوب للوظيفة. يتناول هذا البروتوكول كيف يمنح النشاط الجماعي للمنظمين مجموعات فرعية من الأنابيب الدقيقة القريبة ذات خصائص متميزة. تمكننا عملية الاسترداد هذه من أسفل إلى أعلى من تصور تنظيم وديناميات مجموعات الأنابيب الدقيقة القريبة مثل الأنابيب الدقيقة المفردة والحزم في وقت واحد ، وفك رموز الآليات الكامنة وراء تنظيمها الذاتي.
تتطلب إعادة التشكيل متعددة المكونات تحسين المعلمات التجريبية مثل الرقم الهيدروجيني والقوة الأيونية وتركيز البروتين مع الحفاظ على نشاط كل منها. التحليل المنهجي للمكونات الفردية قبل فحوصات البروتين المتعدد مفيد للغاية. للبدء ، ماصة خليط من 4.5 ميكرولتر من BRB ADDTT في ميكرولتر واحد من محلول microtubule على شريحة المجهر.
قم بتغطيتها بغطاء 18 × 18 ملم وأغلق الحواف إما بطلاء أظافر شفاف أو مانع تسرب VALAP. ضع هدف TIRF أسفل الغطاء الزجاجي. تصور الأنابيب الدقيقة المبلمرة حديثا بطول موجي مناسب للتوبولين المسمى بالفلورسنت في المزيج الساطع لتحديد تخفيف الأنابيب الدقيقة لاستخدامها في التجارب القادمة.
حدد كثافة الليزر للتجربة تجريبيا بحيث تكون جميع البروتينات الفلورية مضاءة ، ولكنها لا تخضع لتبييض ضوئي كبير على مدار فترة التجربة. اضبط درجة حرارة المجهر على 28 درجة مئوية لعرض الأنابيب الدقيقة الديناميكية. استخدم ورق العدسة لتنظيف هدف 100X باستخدام 70٪ من الإيثانول.
استخدم أفضل مزيج من مكعبات المرشح ومرشحات الانبعاثات اعتمادا على قنوات الفلورسنت المراد تصويرها. قم بإعداد تسلسل التصوير. لإجراء تجربة مع 647 نانومتر من الأنابيب الدقيقة البيوتينيل الموسومة بالفلوروفور ، و 560 نانومتر من الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل في توبولين القابل للذوبان ، والبروتين المسمى GFP المثير للاهتمام ، قم بتصوير قنوات 488 نانومتر و 560 نانومتر و 647 نانومتر كل 10 ثوان لمدة 20 أي دقيقة.
لالتقاط صورة مرجعية للحزم قبل إضافة التوبولين القابل للذوبان والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة ، قم بإعداد تسلسل مع صورة واحدة لكل منها في قنوات الطول الموجي 560 نانومتر و 647 نانومتر. تحقق من موضع شعاع الليزر على السقف فوق المجهر وقم بإجراء تغييرات على الشعاع باستخدام البرنامج. تأكد من محاذاة مصباح الليزر.
قبل التصوير ، أضف قطرة من زيت غمر المجهر إلى الهدف. تحضير خليط توبولين القابل للذوبان مع الاحتفاظ به على الجليد وتدوير الخليط. لشل حركة الأنابيب الدقيقة عبر وصلة البيوتين-نيوترافيدين-البيوتين، تدفق أولا في حوالي 7.5 ميكرولتر من محلول نيوترافيدين حتى تمتلئ الغرفة وتحضن لمدة خمس دقائق.
يغسل مع 10 ميكرولتر من MB الباردة. تدفق في 7.5 ميكرولتر من البروتين المانع KC وحضانت لمدة دقيقتين. يغسل مع 10 ميكرولتر من MB دافئة لإعداد الغرفة لإدخال microtubules.
قم بتخفيف مخزون الأنابيب الدقيقة البيوتينيل في BRB ADDTT وأضف ميكرولتر واحد من هذا التخفيف إلى تسعة ميكرولترات من MB الدافئة. تدفق الخليط إلى الغرفة واحتضان لمدة 10 دقائق. اغسل الأنابيب الدقيقة غير المجمدة مع 10 ميكرولترات من MB الدافئة.
تدفق 7.5 ميكرولتر من KC الدافئ إلى الغرفة واحتضان لمدة دقيقتين. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول نانومولي من الوصلة المتقاطعة أو البروتين PRC1 في KC وقم بتدوير المحلول. تدفق 10 ميكرولترات من هذا المحلول إلى غرفة التصوير واحتضان لمدة خمس دقائق.
لصنع حزم ، قم بتدفق 10 ميكرولترات من الأنابيب الدقيقة غير البيوتينيل إلى الغرفة واحتضنها لمدة 10 دقائق. اغسل الغرفة مرتين مع 10 ميكرولتر من MB دافئة. خلال فترة الحضانة التي تبلغ 10 دقائق ، قم بإعداد 10 ميكرولترات من خليط الفحص الذي يحتوي على بروتينات ذات أهمية ، توبولين قابل للذوبان ، نيوكليوتيدات ، زبالة الأكسجين ، ومضادات الأكسدة وقم بتدويرها.
حافظ على الخليط على الجليد. قم بتحميل غرفة التصوير المعدة المسجلة على حامل الانزلاق على هدف 100X TIRF. استخدم قنوات 560 نانومتر و 647 نانومتر للعثور على مجال رؤية يحتوي على العدد الأمثل والكثافة من الأنابيب الدقيقة والحزم المفردة.
بمجرد تحديد مجال الرؤية، التقط صورة مرجعية. تدفق بعناية في خليط الفحص دون إزعاج غرفة التصوير. أغلق الأطراف المفتوحة للغرفة باستخدام مانع التسرب VALAP.
راقب الأنابيب الدقيقة وابدأ تسلسل التصوير. بعد شل حركة بذور الأنابيب الدقيقة وتوليد الحزم ، تم الحصول على صور التألق. تم تحديد الأنابيب الدقيقة المفردة بواسطة إشارة الفلورسنت في قناة 647 نانومتر ، في حين تم تحديد الأنابيب الدقيقة كحزم سابقة التشكيل عندما عرضت إشارات الفلورسنت في كلتا القناتين.
تمت دراسة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة المفردة وحزم PRC1 المتقاطعة في وجود البروتينات KIF4A و CLASP1 ، والتي كشفت أن الأنابيب الدقيقة المفردة تستطيل على مدار الفحص ، في حين أن نمو الأنابيب الدقيقة المتقاطعة متوقف. احرص على الحفاظ على الأنابيب الدقيقة المبلمرة في درجة حرارة الغرفة أو فوقها. احتفظ بالتوبولين القابل للذوبان على الجليد وقم بحماية غرفة التصوير والأنابيب الدقيقة والبروتينات ذات العلامات الفلورية من الضوء.
قدمت هذه الفحوصات نظرة ميكانيكية حول كيفية قيام وحدة البروتين الموجودة في المغزل الانقسامي بتنظيم ديناميكيات مجموعتين مختلفتين من الأنابيب الدقيقة التي تتعايش في المغزل.
