يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء معهد أبحاث علم الأمراض السريرية في مستشفى غرب الصين ، الذين ساهموا في التوجيه الفني لجودة التألق المناعي المتعدد ومعالجة IHC. تم دعم هذا البروتوكول من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82200078).

تمت الموافقة على البروتوكول من خلال المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، الصين. تم الحصول على عينات أنسجة سرطان الرئة أثناء الجراحة في مركز سرطان الرئة في مستشفى غرب الصين ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من كل مريض.
1. إعداد قسم الأنسجة
<ol><li>إعداد FFPE<ol><li>اغمر الأنسجة السريرية في محلول فورمالين محايد لأكثر من 72 ساعة.</li>
		<li>أكمل عملية تجفيف الأنسجة باستخدام الزيلين والمحاليل الكحولية المتدرجة20.</li>
		<li>قم بإجراء التضمين اليدوي للبارافين وتقسيم الأنسجة بسمك مقطع 4 ميكرومتر. استخدم شرائح مجهر الالتصاق للتأكد من عدم سقوط شرائح الأنسجة.</li>
		<li>تخبز الشرائح في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للتأكد من جفاف المناديل والشرائح. تخزينها في صندوق شرائح في درجة حرارة الغرفة.</li>
	</ol></li>
	<li>المعالجة المسبقة لقسم الأنسجة<ol><li>عالج شرائح الأنسجة في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم اغمر بالتتابع في محاليل الزيلين لمدة 2 × 15 دقيقة ، ومحاليل الإيثانول اللامائية لمدة 2 × 15 دقيقة ، ومحلول إيثانول 90٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 85٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 80٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 75٪ لمدة 10 دقائق ، يليه غسل الشرائح بالماء المعقم لمدة 3 × 1 دقيقة. ملاحظة: لا يمكن استخدام هذه التقنية التجريبية إلا لأنسجة FFPE ، وليس للأنسجة المجمدة أو الطازجة ، حيث تتسبب عملية إصلاح المستضد المتعددة ذات درجة الحرارة العالية في سقوط الأنسجة من الشريحة.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تحسين الأجسام المضادة الأولية
ملاحظة: تم استخدام تجارب IHC التقليدية لتحديد ظروف حضانة الأجسام المضادة الفردية ، بما في ذلك تركيز الأجسام المضادة وظروف إصلاح المستضد. راجع الشروط الواردة في دليل تعليمات الأجسام المضادة.
<ol><li>استخدم تركيز الأجسام المضادة أعلى قليلا من نطاق التركيز الموصى به والقيم المتوسطة.</li>
	<li>تحسين إجراءات المخزن المؤقت لاسترجاع المستضد PH6 و PH9 وفقا لموقع تعبير البروتين. استخدم PH9 للبروتينات المعبر عنها في النواة واستخدم إما روتينا (PH6 أو PH9) للبروتينات الأخرى.</li>
</ol>3. طريقة تلطيخ mIHC
ملاحظة: يعد تلطيخ mIHC من الأوبال إحدى طرق mIHC المتاحة. في هذا البروتوكول التجريبي المكون من 5 ألوان ، حيث يجب تلطيخ كل عينة من الأنسجة بأربعة أجسام مضادة ، وأربعة حضانات أولية للأجسام المضادة ، وحضانات ثانوية للأجسام المضادة ، وحضانات كروموجينية لتضخيم إشارة TSA ، بالإضافة إلى خمس عمليات ترميم للمستضد. أخيرا ، يتم إجراء تلطيخ 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وختم عامل الانفجار المضاد للفلورسنت.
<ol><li>إعداد الكاشف الرئيسي ملاحظة: حدد كمية الكاشف المراد إضافتها وفقا لحجم شرائح الأنسجة. استخدم حجما كافيا لتغطية قسم الأنسجة بالكامل (بشكل عام ، 50-150 ميكرولتر لكل شريحة). يتم إعداد حلول العمل المطلوبة للتجربة على النحو التالي:<ol><li>غسل محلول عمل المخزن المؤقت: تمييع 20x اغسل المخزن المؤقت في الساعة 1:20 بالماء المقطر المزدوج ، واحفظه في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>حل عمل المخزن المؤقت PH6: قم بتخفيف المخزن المؤقت 100x PH6 عند 1: 100 بالماء المقطر المزدوج. تحضير قبل الاستخدام وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>حل عمل المخزن المؤقت PH9: قم بتخفيف المخزن المؤقت 50x PH9 في الساعة 1:50 بالماء المقطر المزدوج. تحضير قبل الاستخدام وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>بوليمر HRP: قم بإعداد هذا الحل الجاهز للاستخدام فقط للأجسام المضادة الأولية من أصل الأرانب والفأر.</li>
		<li>محلول عمل الفلوروفور: أعد تكوين كل مسحوق فلوروفور (باستثناء الفلوروفور 780) في 75 ميكرولتر من DMSO. قبل كل إجراء ، قم بتخفيف الفلوروفور في مخفف تضخيم 1x عند 1: 100. تخلص من أي جزء غير مستخدم من محلول عمل الفلوروفور.</li>
		<li>حل عمل Fluorophore 780: إعادة تكوين TSA-DIG في 75 ميكرولتر من DMSO ومسحوق الفلوروفور 780 في 300 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. قبل الإجراء ، قم بتخفيف TSA-DIG في مخفف تضخيم 1x عند 1: 100 ، وتخفيف الفلوروفور 780 مع مخفف Ab في 1:25.</li>
		<li>حل عمل DAPI: قم بتخفيف محلول DAPI في الساعة 1:50 بالماء المقطر المزدوج أو PBS. تحضير قبل الاستخدام وتخزينها على حرارة 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 48 ساعة. ملاحظه. اغسل الشرائح فقط بالماء المقطر المزدوج ومحلول عمل عازل الغسيل المعد حديثا طوال تجربة تلطيخ التألق متعددة الملصقات هذه. يجب ألا تتلامس أقسام الأنسجة مع ماء الصنبور ؛ يمكن أن تلتصق الملوثات الموجودة في ماء الصنبور بأقسام الأنسجة وتسبب التألق الذاتي. احتفظ بالعينات بعيدا عن الضوء طوال التجربة.</li>
	</ol></li>
	<li>استرجاع المستضد<ol><li>ضع الشرائح في صندوق تلطيخ وإصلاح واملأها بمحلول عمل عازل PH6 أو PH9 ، وقم بتغطيتها بالغطاء ، وقم بتسخينها في فرن ميكروويف لمدة 2 × 8 دقائق بطاقة 100٪. ملاحظة: أضف الماء المقطر المزدوج إلى صندوق الإصلاح أثناء عملية التسخين لمنع التبخر المفرط الذي يمكن أن يتسبب في جفاف الشرائح.</li>
		<li>اترك الشرائح لتبرد في درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة (30-60 دقيقة).</li>
		<li>اغسل الشرائح 3 × 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج. استخدم قلم حاجز مسعور لتطويق قسم الأنسجة على الشريحة.</li>
	</ol></li>
	<li>حظر<ol><li>اغمر أقسام الأنسجة في محلول الغسيل ، وقم بتغطيتها بمحلول مانع ، واحتضان الشرائح في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.</li>
	</ol></li>
	<li>حضانة الأجسام المضادة الأولية<ol><li>قم بإزالة محلول الحجب من الشرائح وقم بتغطية أقسام الأنسجة بمحلول عمل الأجسام المضادة الأساسي. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في الثلاجة. ملاحظة: لا تدع الشرائح تجف.</li>
	</ol></li>
	<li>إدخال البوليمر HRP<ol><li>اغسل الشرائح في محلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة. أضف Polymer HRP مباشرة إلى أقسام الأنسجة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: بالنسبة للشرائح المخزنة في الثلاجة ، احتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل الغسيل لإزالة الجسم المضاد الأساسي.</li>
	</ol></li>
	<li>توليد تضخيم إشارة التيرامين (TSA)<ol><li>اغسل الشريحة بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة ، وأضف محلول عمل الفلوروفور مباشرة بالتنقيط إلى أقسام الأنسجة ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشريحة بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة.</li>
	</ol></li>
	<li>إجراء خاص للفلوروفور 780 ملاحظة: الفلوروفور 780 ضعيف ويتم وضعه بشكل روتيني في المرتبة الأخيرة في مخطط مطابقة الألوان للتجربة بأكملها. لا يستخدم Fluorophore 780 عادة في هذا البروتوكول التجريبي ، ولكن بسبب خصوصيته ، يتم سرد خطواته التجريبية.<ol><li>مقدمة من TSA-DIG<ol><li>اغسل الشريحة بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة ، وأضف محلول عمل TSA-Drg بالتنقيط إلى أقسام الأنسجة ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
		</ol></li>
		<li>معالجة الميكروويف<ol><li>اغسل الشرائح بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة.</li>
			<li>ضع الشرائح في صندوق تلطيخ وإصلاح ، واملأها بمحلول إصلاح ، وقم بتغطيتها بالغطاء ، وقم بتسخينها في فرن ميكروويف لمدة 2 × 8 دقائق بطاقة 100٪. اترك الشرائح لتبرد في درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة (30-60 دقيقة).</li>
			<li>اغسل الشرائح لمدة 3 × 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج.</li>
		</ol></li>
		<li>توليد إشارة الفلوروفور 780<ol><li>اغمر الأقسام في محلول الغسيل ، وقم بتغطيتها بمحلول عمل fluorophore 780 ، واحتضان الشرائح في غرفة مرطبة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
			<li>اغسل الشرائح بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة. ملاحظة: لا تقم بإجراء العلاج بالميكروويف بعد هذه الخطوة.</li>
		</ol></li>
		<li>استخدم الفلوروفور 780 كخطوة أخيرة في سير العمل بأكمله ثم قم بتلطيخ النوى مباشرة باستخدام حل عمل DAPI. ملاحظة: تخطي الخطوة 3.7 إذا لم تستخدم الفلوروفور 780.</li>
	</ol></li>
	<li>معالجة الميكروويف ملاحظة: تعمل خطوة الميكروويف هذه على تجريد مركب HRP الأساسي والثانوي وإعادة كشف المستضدات ، مما يسمح بإدخال الجسم المضاد الأساسي التالي.<ol><li>ضع الشرائح في صندوق تلطيخ وإصلاح ، واملأها بمحلول عمل عازل PH6 أو PH9 ، وقم بتغطيتها بالغطاء ، وقم بتسخينها في فرن ميكروويف لمدة 2 × 8 دقائق بقوة 100٪.</li>
		<li>اترك الشرائح لتبرد في درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة (30-60 دقيقة). اغسل الشرائح 3 × 1 دقيقة بالماء المقطر المزدوج.</li>
		<li>تراجع الشرائح في محلول عمل المخزن المؤقت للغسيل لمدة 2 دقيقة. أداء حضانة الأجسام المضادة التالية.</li>
	</ol></li>
	<li>حضانة الأجسام المضادة التالية<ol><li>كرر الخطوات 3.2-3.8 (باستثناء الخطوة 3.7).</li>
	</ol></li>
	<li>تلطيخ الخلية النووية وختم الأنسجة<ol><li>قم بتغطية أقسام الأنسجة بمحلول عمل DAPI واحتضان الشرائح في غرفة مرطبة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح لمدة 3 × 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج.</li>
		<li>قم بإزالة قطرات الماء من الشرائح ، وأضف 10-20 ميكرولتر من المروي المضاد للتألق إلى كل شريحة ، وأغلق الشرائح بزجاج غطاء مجهري.</li>
		<li>تخزين الشرائح النهائية في 4 °C ، محمية من الضوء ، لأكثر من 1 شهر. ملاحظة: احرص على تجنب فقاعات الهواء.</li>
	</ol></li>
</ol>4. إعداد عنصر التحكم السلبي
<ol><li>قم بمعالجة شرائح التحكم السلبية مثل الشرائح المحتوية على الأنسجة ولكن دون إضافة كواشف مثل الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية وكواشف TSA و DAPI ، والتي تستخدم لإزالة التألق الذاتي للأنسجة عند مسح الفيلم.</li>
</ol>5. مسح تلقائي بالكامل لشرائح الأنسجة
ملاحظة: المعدات المستخدمة في التصوير الطيفي عبارة عن محلل تكميمي متعدد الأطياف مؤتمت بالكامل ، ويمكن إجراء تصوير وتحليل الشرائح ذات 5 ألوان باستخدام النظام المرجعي (انظر جدول المواد). يستخدم النظام التصوير متعدد الأطياف للخلط الكمي للفلوروفورات المتعددة والتألق الذاتي للأنسجة.
<ol><li>اضبط وقت التعرض وبرنامج المسح يدويا لكل قناة مضان وتأكد من أن الأداة قد أكملت التعرض التلقائي بالكامل ومسح شرائح الأنسجة. ملاحظة: يجب أن يكون سطح الشريحة نظيفا وخاليا من طبقة الماء. كن حذرا مع كمية مانع التسرب: سيؤدي الإفراط في انزلاق الغطاء وإبلاغ الأداة عن خطأ.</li>
</ol>6. تحليل مضان
<ol><li>انقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج (انظر جدول المواد)، واسحب ملف الصورة الفلورية متعدد الألوان الذي تم الحصول عليه من المسح الضوئي الأصلي إلى البرنامج، واضبط نوع الصورة على مضان.</li>
	<li>انقر فوق زر السطوع والتباين وتحقق من القنوات الموجودة على اللوحة. انقر خارج ثم على القناة لتحديد قناة مضان الاهتمام. اسحب الحد الأدنى للعرض والعرض الأقصى لضبط السطوع والتباين لكل قناة.</li>
	<li>بعد التحليل ، حدد طريقة العرض المراد حفظها ، وانقر فوق إظهار نظرة عامة على الشريحة وإظهار موقع المؤشر لإزالة هذين المحتوىين ، واحتفظ بشريط المقياس ، وانقر فوق ملف | تصدير لقطة | محتوى المشاهد الحالي لتصدير ملف png. ملاحظة: يجب تصدير كل قناة مضان ورقم مدمج للتحليل في المستقبل.</li>
	<li>لمزيد من التحليل لإيجابية الخلية المستهدفة ، استخدم برنامج تحديد الخلايا وتجزئتها21 (انظر جدول المواد).</li>
</ol>

فك رموز البيئة المكروية للورم باستخدام mIHC في سرطان الرئة الحرشفية

<ol>
	<li>Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescent+in+situ+hybridization+and+immunohistochemical+detection+with+tyramide+signal+amplification.">Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).</li><li>Lovisa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+induces+cell+cycle+arrest+and+parenchymal+damage+in+renal+fibrosis.">Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis.</a> Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).</li><li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+with+pembrolizumab+in+advanced+Merkel-cell+carcinoma.">PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li><li>Zaretsky, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+associated+with+acquired+resistance+to+PD-1+blockade+in+melanoma.">Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogeneous+immune+landscape+between+lung+adenocarcinoma+and+squamous+carcinoma+revealed+by+single-cell+RNA+sequencing.">The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).</li><li>Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+direct+and+indirect+immunofluorescence+method+for+determination+of+somatic+cell+count.">Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count.</a> Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).</li><li>Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+immunostaining+approaches+to+study+early+male+germ+cell+development.">Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development.</a> Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Meany, D. L., Hackler, L., Zhang, H., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+antibody-overlay+lectin+microarray:+a+strategy+to+improve+the+sensitivity+of+targeted+glycan+profiling.">Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling.</a> Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).</li><li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+immunofluorescence+panel+for+immuno-oncology+studies+on+formalin-fixed+carcinoma+tissue+specimens.">Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).</li><li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization,+design+and+avoiding+pitfalls+in+manual+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry.">Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging:+a+review+of+its+technical+aspects+and+applications+in+anatomic+pathology.">Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+QUantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuPath:+The+global+impact+of+an+open+source+digital+pathology+system.">QuPath: The global impact of an open source digital pathology system.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).</li><li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QuPath:+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis.">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Experimental+Pathology+Techniques+of+Respiratory+System.">Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System.</a> Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).</li><li>Wilson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data.">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031 (2021).</li><li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+tumor+immune+microenvironment+with+Tyramide-based+multiplex+immunofluorescence.">Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).</li><li>Mansfield, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+context+in+epigenetics:+quantitative+multicolor+imaging+and+automated+per-cell+analysis+of+miRNAs+and+their+putative+targets.">Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets.</a> Methods. 52 (4), 271-280 (2010).</li></ol>

يعلن جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

mIHC هي تقنية تجريبية لا غنى عنها في مجال البحث العلمي للتحليل الكمي والمكاني لعلامات البروتين المتعددة على مستوى الخلية الواحدة في قسم نسيج واحد ، مما يوفر بيانات بديهية ودقيقة لدراسة أمراض المرض من خلال التركيز على بنية الأنسجة التفصيلية والتفاعلات الخلوية في سياق الأنسجة الأصلية. سيتطل...

تضخيم إشارة التيرامين (TSA) ، الذي له تاريخ يزيد عن 20 عاما ، هو فئة من تقنيات الفحص التي تستخدم بيروكسيديز الفجل (HRP) لوضع العلامات عالية الكثافة في الموقع للمستضدات المستهدفة ويتم تطبيقها على نطاق واسع في مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) ، والتهجين في الموقع (ISH) ، والكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) ، وغيرها من التقنيات للكشف عن المستضدات البيولوجية ، تحسين حساسية الإشارة المكتشفة بشكل كبير1. تم مؤخرا تطوير تلطيخ أوبال متعدد الألوان على أساس تقنية TSA واستخدامه على نطاق واسع في العديد من الدراسات2،3،4،5. يوفر التلوين المناعي التقليدي (IF) للباحثين أداة سهلة للكشف عن توزيع البروتينات في خلايا وأنسجة الكائنات الحية النموذجية المختلفة ومقارنتها. يعتمد على الارتباط الخاص بالأجسام المضادة / المستضد ويتضمن طرقا مباشرة وغير مباشرة6. يتضمن التلوين المناعي المباشر استخدام جسم مضاد أولي مقترن بالفلوروفور ضد المستضد محل الاهتمام ، مما يتيح الكشف الفلوري المباشر باستخدام مجهر مضان. يتضمن نهج التلوين المناعي غير المباشر تطبيق جسم مضاد ثانوي مقترن بالفلوروفور ضد الجسم المضاد الأولي غير المقترن 6,7.
يمكن لطرق تلطيخ التألق المناعي التقليدية أحادية التسمية أن تلطخ مستضدا واحدا أو اثنين أو في بعض الحالات ثلاثة مستضدات في الأنسجة ، وهو قيد رئيسي في استخراج المعلومات الغنية الموجودة في أقسام الأنسجة. غالبا ما يعتمد تفسير النتائج الكمية على الملاحظة البصرية والقياس الكمي الدقيق بواسطة برامج التصوير ، مثل ImageJ. هناك قيود تقنية ، مثل تقييد أنواع الأجسام المضادة ، وإشارات الملصقات الفلورية الضعيفة ، وتداخل لون صبغة الفلورسنت (الجدول 1). تعتمد تقنية Opal multiplex IHC (mIHC) على اشتقاق TSA ، والذي يسمح بتلطيخ متعدد الإرسال ووضع العلامات التفاضلية لأكثر من 7-9 مستضدات على نفس قسم الأنسجة ، دون قيود على أصل الجسم المضاد الأساسي ، ولكنه يتطلب خصوصية عالية للجسم المضاد المقابل ضد المستضد. يشبه إجراء التلوين إجراء التلوين المناعي الطبيعي ، باستثناء اختلافين: تتضمن كل جولة من التلوين استخدام جسم مضاد واحد فقط ويتم إضافة خطوة شطف الأجسام المضادة. يمكن إزالة الأجسام المضادة المرتبطة بالمستضد بواسطة روابط غير تساهمية عن طريق شطف الميكروويف ، ولكن يتم الاحتفاظ بإشارة الفلورسنت TSA المرتبطة بسطح المستضد بواسطة الروابط التساهمية.
جزيئات التيرامين المنشط (T) الموسومة بالصبغة غنية للغاية في المستضد المستهدف ، مما يسمح بالتضخيم الفعال لإشارة الفلورسنت. يسمح ذلك بوضع العلامات المباشرة للمستضد دون تدخل الأجسام المضادة ، ومن ثم يمكن تحقيق وضع العلامات متعددة الألوان بعد دورات تلطيخ متعددة8،9،10 (الشكل 1). على الرغم من أن هذه التقنية تنتج صورا موثوقة ودقيقة لدراسة المرض ، إلا أن إنشاء استراتيجية تلطيخ مفيدة للكيمياء المناعية الفلورية المتعددة (mfIHC) يمكن أن يستغرق وقتا طويلا ودقيقا بسبب الحاجة إلى التحسين والتصميم الشاملين. لذلك ، تم تحسين بروتوكول اللوحة المتعددة هذا في ملطخ IHC الآلي مع وقت تلطيخ أقصر من البروتوكول اليدوي. يمكن تطبيق هذا النهج وتكييفه مباشرة من قبل أي باحث لدراسات الأورام المناعية على عينات الأنسجة البشرية الثابتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين (FFPE)11. علاوة على ذلك ، فإن طرق إعداد الشرائح وتحسين الأجسام المضادة وتصميم تعدد الإرسال ستكون مفيدة في الحصول على صور قوية تمثل تفاعلات خلوية دقيقة في الموقع وتقصير فترة التحسين للتحليل اليدوي12.
يتضمن mfIHC بشكل أساسي الحصول على الصور وتحليل البيانات. فيما يتعلق بالحصول على الصور ، يجب الكشف عن العينات المعقدة متعددة الألوان باستخدام معدات التصوير الطيفي الاحترافية لتحديد إشارات الألوان المختلطة المختلفة والحصول على صور عالية الإشارة إلى الضوضاء دون تدخل من التألق الذاتي للأنسجة. تشمل المعدات الحالية للتصوير الطيفي بشكل أساسي المجاهر الطيفية متحدة البؤر وأنظمة تصوير الأنسجة متعددة الأطياف. نظام تصوير الأنسجة متعدد الأطياف هو نظام تصوير احترافي مصمم للتحليل الكمي لأقسام الأنسجة ، وأهم ميزة له هي الحصول على المعلومات الطيفية للصور ، والتي توفر كلا من البنية المورفولوجية ومعلومات رسم الخرائط البصرية لعينات الأنسجة البيولوجية13,14. يحتوي أي بكسل في الصورة الطيفية على منحنى طيفي كامل ، ولكل صبغة (بما في ذلك التألق الذاتي) طيفها المميز المقابل ، والذي يتيح التسجيل الكامل والتحديد الدقيق للإشارات متعددة الملصقات المختلطة والمتداخلة.
من حيث تحليل البيانات ، فإن العينات ذات العلامات متعددة الألوان معقدة للغاية بسبب التركيب المورفولوجي والخلايا المكونة لعينات الأنسجة. لا يمكن للبرامج العادية تحديد أنواع الأنسجة المختلفة تلقائيا. ومن ثم ، يتم استخدام برنامج تحليل الأنسجة الكمي الذكي للتحليل الكمي للتعبير عن المستضد في مناطق محددة15،16،17،18.
قبل كل شيء ، يتميز تلطيخ التألق المناعي متعدد العلامات المنصهر مع التصوير متعدد الأطياف وتكنولوجيا تحليل الأمراض الكمي بمزايا عدد كبير من أهداف الكشف ، والتلوين الفعال ، والتحليل الدقيق ، وبالتالي يمكنه تحسين دقة التحليل النسيجي بشكل كبير ، والكشف عن العلاقة المكانية بين البروتينات ذات الدقة الخلوية ، والمساعدة في استخراج معلومات أكثر ثراء وموثوقية من عينات قسم الأنسجة19 (الجدول 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab237709</td>
			<td>Primary antibody, 1/100, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab955</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CK5/6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1620</td>
			<td>Primary antibody, 1/150, PH9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HMGCS1</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX112346</td>
			<td>Primary antibody, 1/300, PH6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal nonimmune serum</td>
			<td>MXB Biotechnologies</td>
			<td>SP KIT-B3</td>
			<td>Antigen blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluormount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Anti-fluorescent burst</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit</td>
			<td>Akoya</td>
			<td>NEL861001KT</td>
			<td>Opal mIHC Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K8000/K8002/K8007/K8023</td>
			<td>Washing the tissues slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, paid software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerkinElmer Vectra</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue

سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات المرتبطة بالأورام الخبيثة في جميع أنحاء العالم ، وقد اعتبرت البيئة المكروية المعقدة للورم السبب الرئيسي للوفاة في مرضى سرطان الرئة. يتطلب تعقيد البيئة المكروية للورم طرقا فعالة لفهم العلاقات بين الخلايا في أنسجة الورم. أصبحت تقنية الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة (mIHC) أداة رئيسية لاستنتاج العلاقة بين التعبير عن البروتينات في المنبع والمصب لمسارات الإشارات في أنسجة الورم وتطوير التشخيصات السريرية وخطط العلاج. mIHC هي طريقة تلطيخ مناعي متعدد الملصقات تعتمد على تقنية تضخيم إشارة التيرامين (TSA) ، والتي يمكنها اكتشاف جزيئات مستهدفة متعددة في نفس عينة قسم الأنسجة في وقت واحد لتحقيق تعبير مشترك مختلف للبروتين وتحليل التوطين المشترك. في هذا البروتوكول التجريبي ، تعرضت أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين لسرطان الرئة الحرشفية من أصل سريري لتلطيخ كيميائي مناعي متعدد الإرسال. من خلال تحسين البروتوكول التجريبي ، تم تحقيق تلطيخ كيميائي مناعي متعدد للخلايا والبروتينات المستهدفة المصنفة ، مما أدى إلى حل مشكلة التألق الذاتي والحديث المتبادل للقناة في أنسجة الرئة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام التلوين الكيميائي المناعي المتعدد على نطاق واسع في التحقق التجريبي من التسلسل عالي الإنتاجية المرتبط بالورم ، بما في ذلك تسلسل الخلية الواحدة ، والبروتينات ، وتسلسل مساحة الأنسجة ، مما يوفر نتائج تحقق بديهية وبصرية لعلم الأمراض.

Tyramine signal amplification (TSA), which has a history of more than 20 years, is a class of assay techniques that use horseradish peroxidase (HRP) for high-density in situ labeling of target antigens and is widely applied in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), in situ hybridization (ISH), immunohistochemistry (IHC), and other techniques for the detection of biological antigens, substantially improving the sensitivity of the detected signal1. Opal polychromatic staining based on TSA technology has been recently developed and widely used in several studies2,3,4,5. Traditional immunofluorescence (IF) staining provides researchers with an easy tool for the detection and comparison of the distribution of proteins in the cells and tissues of various model organisms. It is based on antibody-/antigen-specific binding and includes direct and indirect approaches6. Direct immunostaining involves the use of a fluorophore-conjugated primary antibody against the antigen of interest, which enables direct fluorescent detection using a fluorescence microscope. The indirect immunostaining approach involves the application of a fluorophore-conjugated secondary antibody against the unconjugated primary antibody6,7.
Traditional, single-label, immunofluorescence staining methods can stain only one, two, or in some cases, three antigens in tissues, which is a major limitation in mining the rich information contained in tissue sections. The interpretation of quantitative results often depends on visual observation and accurate quantification by imaging software, such as ImageJ. There are technical limitations, such as antibody species restriction, weak fluorescent label signals, and fluorescent dye color overlap (Table 1). The Opal multiplex IHC (mIHC) technique is based on TSA derivation, which allows multiplex staining and differential labeling of more than 7-9 antigens on the same tissue section, with no restriction on the origin of the primary antibody, but requires high specificity of the corresponding antibody against the antigen. The staining procedure is similar to that of normal immunofluorescence staining, except for two differences: each round of staining involves the use of only one antibody and an antibody elution step is added. Antibodies bound to the antigen by noncovalent bonds can be removed by microwave elution, but the TSA fluorescent signal bound to the surface of the antigen by covalent bonds is retained.
Activated tyramine (T) molecules labeled with the dye are highly enriched at the target antigen, allowing efficient amplification of the fluorescent signal. This allows direct labeling of the antigen without antibody interference, and then multicolor labeling can be achieved after multiple staining cycles8,9,10 (Figure 1). Although this technology produces reliable and accurate images for the study of disease, the creation of a useful multiplex fluorescent immunohistochemistry (mfIHC) staining strategy can be time-consuming and exacting due to the need for extensive optimization and design. Therefore, this multiplex panel protocol has been optimized in an automated IHC stainer with a shorter staining time than that of the manual protocol. This approach can be directly applied and adapted by any researcher for immuno-oncology studies on human formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue samples11. Moreover, the methods for slide preparation, antibody optimization, and multiplex design will be helpful in obtaining robust images that represent accurate cellular interactions in situ and to shorten the optimization period for manual analysis12.
The mfIHC mainly includes image acquisition and data analysis. In terms of image acquisition, multicolor-labeled complex-stained samples need to be detected with professional spectral imaging equipment to identify the various mixed color signals and obtain high signal-to-noise images without interference from tissue autofluorescence. Current equipment for spectral imaging mainly includes spectral confocal microscopes and multispectral tissue imaging systems. The multispectral tissue imaging system is a professional imaging system designed for the quantitative analysis of tissue sections, and its most important feature is the acquisition of image spectral information, which provides both morphological structure and optical mapping information of biological tissue samples13,14. Any pixel in the spectral image contains a complete spectral curve, and each dye (including autofluorescence) has its corresponding characteristic spectrum, which enables the complete recording and accurate identification of mixed and overlapping multilabel signals.
In terms of data analysis, multicolor-labeled samples are extremely complex due to the morphological structure and constituent cells of the tissue samples. Ordinary software cannot automatically identify different tissue types. Hence, intelligent quantitative tissue analysis software is used for quantitative analysis of antigen expression in specific regions15,16,17,18.
Above all, multilabel immunofluorescence staining fused with multispectral imaging and quantitative pathology analysis technology has the advantages of a large number of detection targets, effective staining, and accurate analysis, and it can therefore significantly improve the accuracy of histomorphological analysis, reveal the spatial relationship between proteins with cellular-level resolution, and help to mine richer and more reliable information from tissue section samples19 (Table 1).

تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز توطين مضان متعدد الألوان في عينة سرطان الرئة

تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة لأنسجة سرطان الرئة المضمنة في البارافين

Our research focused on optimizing the mIHC protocol on paraffin section obtained from clinic sources. We aimed to effectively address autofluorescence and autofluorescence channel crosstalk issues in lung tissue. The current experimental challenges we are facing involve addressing the issues of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissue, whereby achieving successful multicolor fluorescence localization they need for labeled target cells and proteins.Our highly efficient multiple antigen in situ labeling method, which requires less than three hours per antibody, seamlessly integrates a multispectral imaging system and a specialized pathology software. This optimized mIHC protocol is easily adaptable for use in other research laboratories.

قمنا بتحسين مخطط المطابقة للأجسام المضادة الأولية CD8 والفلوروفور. تتوافق كلتا المجموعتين من نتائج التألق مع نفس ظروف حضانة الأجسام المضادة بالضبط في المجموعة التجريبية ، باستثناء التغيير في الفلوروفور المطابق للأجسام المضادة. كما هو موضح في الشكل 2 ، كان هناك اختلاف كبير ...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue at JoVE.com

يصف هذا البروتوكول التجريبي ويحسن طريقة تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة (IHC) ، وذلك أساسا عن طريق تحسين ظروف حضانة الأجسام المضادة أحادية القناة وضبط إعدادات الأجسام المضادة والقنوات لحل مشاكل التألق الذاتي وتداخل القناة في أنسجة سرطان الرئة ذات الأصل السريري.

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

ركز بحثنا على تحسين بروتوكول mIHC على قسم البارافين الذي تم الحصول عليه من مصادر العيادة. كنا نهدف إلى معالجة مشكلات الحديث المتبادل لقناة التألق الذاتي والتألق الذاتي بشكل فعال في أنسجة الرئة. تتضمن التحديات التجريبية الحالية التي نواجهها معالجة مشكلات التألق الذاتي وتداخل القنوات في أنسجة الرئة ، حيث تحقيق توطين مضان ناجح متعدد الألوان يحتاجون إليه للخلايا والبروتينات المستهدفة المسمى.طريقة وضع العلامات على المستضد المتعدد عالية الكفاءة في الموقع ، والتي تتطلب أقل من ثلاث ساعات لكل جسم مضاد ، تدمج بسلاسة نظام تصوير متعدد الأطياف وبرنامج متخصص في علم الأمراض. بروتوكول mIHC المحسن هذا قابل للتكيف بسهولة للاستخدام في مختبرات الأبحاث الأخرى.

multiplex-immunohistochemistry-staining-for-paraffin-embedded-lung

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

1.2K Views.  Sichuan University. ركز بحثنا على تحسين بروتوكول mIHC على قسم البارافين الذي تم الحصول عليه من مصادر العيادة. كنا نهدف إلى معالجة مشكلات الحديث المتبادل لقناة التألق الذاتي والتألق الذاتي بشكل فعال في أنسجة الرئة. تتضمن التحديات التجريبية الحالية التي نواجهها معالجة مشكلات التألق الذاتي وتداخ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تعزيز توطين مضان متعدد الألوان في عينة سرطان الرئة

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been considered the leading cause of death in lung cancer patients. The complexity of the tumor microenvironment requires effective methods to understand cell-to-cell relationships in tumor tissues. The multiplex immunohistochemistry (mIHC) technique has become a key tool for inferring the relationship between the expression of proteins upstream and downstream of signaling pathways in tumor tissues and developing clinical diagnoses and treatment plans. mIHC is a multi-label immunofluorescence staining method based on Tyramine Signal Amplification (TSA) technology, which can simultaneously detect multiple target molecules on the same tissue section sample to achieve different protein co-expression and co-localization analysis. In this experimental protocol, paraffin-embedded tissue sections of lung squamous carcinoma of clinical origin were subjected to multiplex immunohistochemical staining. By optimizing the experimental protocol, multiplex immunohistochemical staining of labeled target cells and proteins was achieved, solving the problem of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissues. In addition, multiplex immunohistochemical staining is widely used in the experimental validation of tumor-related, high-throughput sequencing, including single-cell sequencing, proteomics, and tissue space sequencing, providing intuitive and visual pathology validation results.

This experimental protocol describes and optimizes a multiplex immunohistochemistry (IHC) staining method, mainly by optimizing single-channel antibody incubation conditions and adjusting the settings of antibodies and channels to solve the problems of autofluorescence and channel crosstalk in lung cancer tissues of clinical origin.

Optimizing Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Staining for Lung Cancer Tissue Samples to Address Autofluorescence Issues

To begin, obtain previously prepared formula and fixed and paraffin embedded lung cancer tissue sample slide. Incubate it at 65 degrees Celsius for five minutes. Perform dehydration by immersing the slide in xylene, followed by ethanol solutions of decreasing concentrations.Then immerse the slides in sterilized water three times for one minute each. For antigen retrieval, place the slide in a staining and repair box. Fill it with immunohistochemical antigen repair buffer working solution of pH six or nine.Cover the box with a lid, and heat it in a microwave oven for eight minutes at 100%power. Then cool the slide to room temperature. Cover the tissue with a blocking solution, and then incubate in a humidified chamber at room temperature for 10 minutes.After removing the blocking solution, cover the slide with the primary antibody working solution, and place it in a humidified chamber. Then incubate this chamber for one hour at 37 degrees Celsius. Next, wash the slide with wash buffer working solution for two minutes.Add polymer horseradish peroxidase directly dropwise onto the slide, and incubate it for 15 minutes at room temperature. After washing the slide, add fluorophore working solution directly dropwise onto the slide, and incubate it for 10 minutes at room temperature. Once the slide is washed, give microwave treatment as demonstrated previously.When the slide is cooled to room temperature, wash it three times with double distilled water for one minute each. Next, dip the slide in the wash buffer working solution for two minutes, and perform antibody incubation, horseradish peroxidase, and fluorophore addition as demonstrated. For cell nuclear staining, cover the slide with DAPI working solution and incubate it in a humidified chamber for five minutes at room temperature.Then wash the slides with double distilled water three times, one minute each. Remove water droplets from the slide. Add 10 to 20 microliters of anti-fluorescence quencher to the slide, and seal it with a microscope cover glass.

تحسين تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة (mIHC) لعينات أنسجة سرطان الرئة لمعالجة مشكلات التألق الذاتي

Analyzing Fluorescence in Lung Cancer Tissue Samples Stained with Optimized Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Technique

To begin, obtain previously prepared stained lung cancer tissue sample slides. For automatic scanning of the stained slides, manually set the exposure time and scanning program for each fluorescence channel. Drag the multicolor fluorescence image file obtained from the original scan into the software and set the image type to fluorescence.Click the brightness and contrast button and check the channels on the panel. Click outside and then on the channel to select the fluorescence channel of interest. Drag the minimum display and maximum display to adjust the brightness and contrast of each channel.Once the view to be saved is determined, click on show slide overview and show cursor location to remove these two contents and keep the scale bar. Click file followed by export snapshot and current viewer content To export a PNG file. The non-small cell lung squamous carcinoma tissues showed that macrophages and CD eight positive T-cells significantly infiltrated around and within carcinoma foci.HMGCS1 protein exhibited widespread expression in squamous carcinoma cell plasma.