이러한 프로토콜은 단일 세포 분해능 정량화, 마커 동시 발현 및 포르말린 고정 및 파라핀 포매 및 신선한 냉동 조직 샘플을 사용한 특수 분석을 가능하게 하여 암에서 면역 세포의 역할을 해명합니다. 이 기술은 단일 조직 섹션에서 40 마커의 동시 특성화를 용이하게하고 샘플에서 조직의 구조를 널리 보존하는 강력한 도구입니다. 중요한 단계는 항체 최적화 및 검증입니다.
단계를 완료하지 못하면 이미지 품질이 낮아져 고품질의 재현 가능한 데이터 및 결과가 손상될 수 있습니다. 모든 항체 함유 튜브를 10, 000 x G에서 5 분 동안 스핀 다운하여 시작하고 개별 항체를 블로킹 버퍼에 추가하고 잘 혼합하십시오. 피펫팅할 때 항체 튜브의 바닥을 방해하지 마십시오.
0.1 마이크로미터 원심 필터 장치를 100 마이크로리터의 블로킹 완충액으로 사전 습윤시켜 항체 패널을 여과한다. 필터를 10, 000 x G에서 2분 동안 돌리고 피펫으로 블로킹 버퍼 유동을 제거합니다. 그런 다음 항체 패널을 스핀 컬럼으로 옮기고 필터를 10, 000 x G에서 2 분 동안 회전시킵니다.
스핀 컬럼을 폐기하고 플로우 스루를 여과된 항체 패널로 사용합니다. 항체 염색의 경우 각 슬라이드를 옆으로 기울이고 작업 와이퍼에 가장자리를 부드럽게 두드려 슬라이드에서 차단 버퍼를 제거합니다. 슬라이드를 수분 챔버에 넣고 100 내지 200 마이크로리터의 항체 마스터 믹스를 조직에 첨가한다.
양성 및 음성 대조군 슬라이드를 염색 배치에 추가하고 슬라이드를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 기기를 설정하려면 제어 소프트웨어에 로그인하고 기기가 절전 모드인 경우 Wake Up(깨우기)을 클릭합니다. Exchange 샘플을 클릭하여 슬라이드를 로드한 다음 계속을 클릭하여 문을 엽니다.
샘플이 위를 향하고 오른쪽에 레이블이 있는 로딩 슬롯에 슬라이드를 넣고 계속을 클릭하여 문을 닫습니다. 프로젝트를 선택한 다음 로드된 샘플의 슬라이드 이름을 선택합니다. 시야 또는 FOV 선택을 위해 슬라이드 광학 이미지 창에서 파노라마 이미지를 시각화하고 모드 메뉴를 클릭하고 2차 전자 검출기를 선택한 다음 이미징 모드 메뉴를 클릭하고 QC 300마이크로미터를 선택합니다.
조그 스테이지를 클릭하여 FOV 위치를 제어한 다음 화살표를 클릭하여 FOV의 위치를 탐색하고 선택합니다. FOV 추가를 클릭하고 필드 크기로 400마이크로미터 x 400마이크로미터를 설정하고 이미징 모드로 정밀을 선택하고 유지 시간 1밀리초를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. FOV 목록을 만든 후 이미지 초점으로 진행하고 빔을 이미징되지 않을 조직 영역으로 이동하여 Stigmation을 조정합니다.
명확한 중앙 이미지를 얻을 때까지 매개 변수를 조정하고 Start Run을 클릭하십시오. 획득한 이미지는 웹 기반 이미지 관리 애플리케이션에 자동으로 업로드되어 저장됩니다. 여기에 표시된 매트릭스는 프로브 순도와 산화물에서 파생된 누화 백분율을 설명합니다.
여기서 파란색 상자는 0.5% 누화 이상을 나타내고 투명 상자는 0.5% 누화 미만을 나타냅니다. Mass 태그의 경우 최소 0.5%누화에 기여한 프로브가 채널에 없거나 하나 또는 두 개 이상의 채널이 여기에 표시됩니다. 프로브 없음, 하나 또는 두 개의 프로브 또는 두 개 이상의 프로브에서 최소 0.5%누화를 수신하는 질량 채널도 표시됩니다.
폐 선암, 비종양성 신장 및 편도선과 같은 다양한 조직의 대표적인 염색 이미지가 여기에 묘사되어 있습니다. 이 기술을 사용하여 염색되고 필터링 및 보정 전에 타사 디지털 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 시각화된 편도선 조직 섹션의 이미지가 여기에 표시됩니다. 필터링 및 수정 단계 후 동일한 조건에서 동일한 섹션의 이미지가 여기에 표시됩니다.
이 방법은 타사 디지털 이미지 분석 소프트웨어에 업로드할 수 있는 이미지를 생성하여 조직 구획화, 세포 분할, 마커 공동 발현, 이웃 분석 및 원거리 분석과 같은 포괄적인 분석을 가능하게 합니다. 고도의 멀티플렉스 이미징 방법은 연구를 통해 사용할 수 있습니다. 다양한 패널을 구성함으로써 연구자들은 암, 정상, 부신 생물, 염증 및 감염성 샘플을 조사 할 수 있습니다.
