これらのプロトコルにより、単一細胞分解能の定量、マーカーの共発現、およびホルマリン固定およびパラフィン包埋および新鮮な凍結組織サンプルを使用した特別な分析が可能になり、がんにおける免疫細胞の役割を解明できます。この技術は、単一の組織切片上の40マーカーの同時特性評価を容易にし、サンプル中の組織の構造を広く保存する強力なツールです。重要なステップは、抗体の最適化と検証です。
ステップを完了しないと、低品質の画像をもたらす可能性があり、高品質の再現性のあるデータおよび結果の保持を損なう可能性があります。まず、すべての抗体含有チューブを10, 000 x Gで5分間スピンダウンし、個々の抗体をブロッキングバッファーに加えてよく混合します。抗体チューブをピペッティングする際には、抗体チューブの底を乱さないでください。
0.1マイクロメートルの遠心フィルター装置を100マイクロリットルのブロッキングバッファーで事前に濡らして、抗体パネルをろ過します。フィルターを10, 000 x Gで2分間回転させ、ピペットでブロッキングバッファーフロースルーを除去します。次に、抗体パネルをスピンカラムに移し、フィルターを10, 000 x Gで2分間回転させます。
スピンカラムを破棄し、フロースルーをろ過された抗体パネルとして使用します。抗体染色では、各スライドを横向きに傾け、タスクワイパーに端を軽くたたき、スライドからブロッキングバッファーを取り除きます。スライドを水分チャンバーに入れ、100〜200マイクロリットルの抗体マスターミックスを組織に加えます。
ポジティブおよびネガティブコントロールスライドを染色バッチに追加し、スライドを摂氏4度で一晩インキュベートします。機器をセットアップするには、制御ソフトウェアにログインし、機器がスリープモードの場合は[ウェイクアップ]をクリックします。[サンプルの交換]をクリックしてスライドをロードし、[続行]をクリックしてドアを開きます。
サンプルを上に向けて右側のラベルを付けてスライドをローディングスロットに入れ、[続行]をクリックしてドアを閉じます。プロジェクトを選択し、読み込まれたサンプルのスライド名を選択します。視野またはFOV選択のためにスライド光学画像ペインでパノラマ画像を視覚化し、[モード]メニューをクリックして[二次電子検出器]を選択し、[イメージングモード]メニューをクリックしてQC 300マイクロメータを選択します。
ジョグステージをクリックしてFOVの位置を制御し、矢印をクリックしてFOVの位置をナビゲートして選択します。[FOVの追加]をクリックし、フィールドサイズとして400マイクロメートル×400マイクロメートルを設定し、[イメージングモード]として[ファイン]を選択し、1ミリ秒の滞留時間を選択して、[確認]をクリックします。FOVリストを作成したら、画像の焦点に進み、画像化されない組織領域にビームを移動して柱描を調整します。
明確な中央画像が得られるまでパラメータを調整し、[実行の開始]をクリックします。取得した画像は自動的にアップロードされ、Webベースの画像管理アプリケーションに保存されます。ここに示すマトリックスは、プローブの純度と酸化物に由来するクロストークの割合を表しています。
ここで、青いボックスは0.5%以上のクロストークを示し、クリアボックスは0.5%未満のクロストークを示します。マスタグの場合、チャンネルなし、1つまたは2つのチャンネル、または2つ以上のチャンネルに少なくとも0.5%のクロストークをもたらしたプローブがここに表示されます。プローブなし、1つまたは2つのプローブ、または2つ以上のプローブから少なくとも0.5%のクロストークを受信するマスチャネルも表示されます。
肺腺癌、非腫瘍性腎臓、扁桃腺などのさまざまな組織における代表的な染色像がここに示されています。この技術を使用して染色され、フィルタリングと補正の前にサードパーティのデジタル画像分析ソフトウェアプログラムを使用して視覚化された扁桃腺組織切片の画像がここに表示されます。フィルタリングと補正の手順を行った後の同じ条件での同じセクションの画像がここに示されています。
この方法は、サードパーティのデジタル画像解析ソフトウェアにアップロードできる画像を生成し、組織の区画化、細胞セグメンテーション、マーカー共発現、近傍分析、遠隔分析などの包括的な分析を可能にします。研究を通じて、高度に多重化されたイメージング法が利用可能です。さまざまなパネルを構築することにより、研究者は癌、正常、腫瘍随伴、炎症性および感染性のサンプルを調査できます。
